Fourier-Transform-Infrarot-mikrospektroskopische Charakterisierung transmissibler spongiformer Enzephalopathien

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, Krankheiten vom TSE-Typ mit Hilfe der Infrarotspektroskopie zu untersuchen, wobei es insbesondere darum ging, weitere Informationen über den molekularen Hintergrund derartiger Erkrankungen zu gewinnen und möglicherweise Ansätze für die Erkennung der Krankheit bzw. Testverfahren in relativ frühen Stadien zu finden. Die Messungen konzentrierten sich auf verschiedene anatomische Strukturen im Hirnstamm und im Kleinhirn oral mit dem Scrapie-Erreger 263K infizierter Individuen eines Laborstammes von Mesocricetus auratus sowie auf die Untersuchung von Spinalganglien.

Die Entwicklung und Optimierung entsprechender Auswertungsalgorithmen bildete die Grundlage für einen gezielten Vergleich von Spektren spezifischer anatomischer Strukturen. Mapping-Experimente, bei denen ortsaufgelöst Infrarotspektren von Dünnschnitten des Hirngewebes aufgenommen wurden, dienten der groben Kartierung histologischer Strukturen in einer coronalen Ebene der Medulla oblongata und einer zweiten Schnittebene im Kleinhirn. Für Vergleichszwecke wurden parallel immunhistochemisch und konventionell gefärbte sequentielle Schnitte der IR-Proben herangezogen. In Bereichen des Nucleus nervi hypoglossi (HypN), des Nucleus dorsalis nervi vagi (DMNV) und des Nucleus tracti solitarii (SolN), sowie einem Areal aus dem Nucleus interpositus cerebelli (IntN) wurden dann detaillierte Messungen durchgeführt. Mit Hilfe der Clusteranalyse und einem darauf beruhenden Bildgebungsverfahren wurden alle für diese Strukturen spezifischen Spektren aus den Datensätzen extrahiert und für systematische Vergleiche zwischen infizierten und Kontrollhirnen verwendet.

Beim Vergleich von Spektren aus mehreren Individuen wurden im terminalen Stadium von Scrapie 263K für alle untersuchten anatomischen Strukturen in mehreren Bereichen der Spektren charakteristische Unterschiede zwischen den infizierten Hamstern und den Tieren der Kontrollgruppe festgestellt. Zu früheren Zeitpunkten (120 d.p.i., 90 d.p.i. waren die Unterschiede zwischen den Mittelwerten auf den Bereich zwischen 1300 und 1000cm-1 begrenzt. Die Unterschiede zwischen den Spektren belegten komplexe, fingerabdruckähnliche Veränderungen von Membrankomponenten, Kohlenhydraten, Nukleinsäuren und Proteinen. Diese unterschieden sich qualitativ und quantitativ zwischen den verschiedenen untersuchten anatomischen Strukturen und für die verschiedenen Infektionsstadien. Es konnte eine gute Übereinstimmung der IR- spektroskopischen Daten aus dieser Arbeit mit anderen Pathogenese- Untersuchungen auf Grundlage der PrPSc-Markierung festgestellt werden. Diese betrifft insbesondere das Ausmaß und die Detektierbarkeit der spektralen Änderungen im Krankheitsverlauf ausgehend vom DMNV und vom SolN. Mittels Mustererkennungsmethoden wie der hierarchischen Clusteranalyse konnten die Einzelspektren aller untersuchten Hirnstrukturen der terminal kranken Hamster von denen der Kontrollgruppe klar getrennt werden. Die Anwendung von künstlichen neuronalen Netzen für die Spektrenidentifizierung gestattete auch 90 d.p.i. eine Unterscheidung der Spektren aus infiziertem und nicht- infiziertem Gewebe mit einer Genauigkeit von ca. 80% in allen untersuchten Strukturen. Damit konnte gezeigt werden, daß sich Scrapie-infiziertes Hirngewebe bereits im präklinischen Stadium anhand von IR-spektroskopisch detektierbaren molekularen Änderungen identifizieren läßt.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum ersten Mal IR-mikrospektroskopische Messungen an einzelnen Nervenzellen in Spinalganglien durchgeführt. Aus den Ergebnissen dieser Untersuchungen geht hervor, daß innerhalb von Ganglien infizierter Hamster lokal auf sehr kleine Flächen begrenzt Proteinaggregate mit erhöhtem Anteil an ß-Faltblatt-Struktur nachweisbar sind. Damit konnte gezeigt werden, daß ein direkter in situ-Nachweis von PrPSc-Aggregaten in IR- Spektren bei genügend hoher Ortsauflösung prinzipiell möglich ist.

In this thesis, Scrapie-infected tissue was investigated by Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy, a vibrational spectroscopic method. The aim of the work was to gain more information on molecular aspects of TSE pathogenesis. The study concentrated on important anatomical structures of the brain stem and cerebellum, as well as on the investigation of dorsal root ganglia of 263K scrapie-infected Syrian hamsters (Mesocricetus auratus). IR spectra were acquired from cryotomized tissue sections by IR microspectroscopic mapping. Adjacent tissue sections were stained for comparison using immunohistochemical and standard histological procedures. To compare identical anatomical structures in scrapie-infected and control brains, new methods suited for the analysis of large amounts of data and for the identification of specific anatomical structures were developed and optimized. Anatomical structures were identified by applying a combination of univariate and multivariate imaging methods. Based on overview maps which were acquired using a lateral resolution of 100µm and constructed using the protein/lipid ratio, areas containing the hypoglossal nucleus (HypN), the dorsal motor nucleus of the vagus nerve (DMNV) and parts of the solitary tract nucleus (SolN) in the medulla oblongata, as well as an area containing the interposed cerebellar nucleus (IntN) were identified and examined in depth in detailed measurements applying a resolution of 50µm. Spectral classification according to the known histological structures was achieved by employing the spectral information over the fingerprint spectral region of 1480-950cm-1 in hierarchical cluster analyses and pattern-based image reconstruction. Based on the results of these cluster analyses, spectra of DMNV/SolN, HypN and IntN were extracted from the data sets and used for systematic comparison between identical structures in scrapie-infected and control tissue.

The spectra obtained from these structures in infected and control animals were compared at three stages of scrapie (90 d.p.i., 120 d.p.i., and at the terminal stage). At terminal stage, differences between spectra were found for all investigated structures throughout the whole spectral range. At 120 d.p.i. and 90 d.p.i. changes were confined to the spectral region 1300-1000cm-1. The spectral alterations reflected complex, fingerprint-like changes of membrane components, carbohydrates, nucleic acids, and proteins. They differed qualitatively and quantitatively between the different stages of infection and brain structures. It could be shown that the data were in good agreement with results from immunocytochemical investigations of scrapie pathogenesis. The majority of spectra from diseased and control tissue could be clearly separated by cluster analysis in the terminal stage and at 120 d.p.i. Application of artificial neural networks based on feature selection by variance analysis yielded an identification accuracy of 80% at 90 d.p.i., indicating that based on molecular changes scrapie-infected brain tissue can be identified even in the pre-clinical stage. In a pilot study, high quality IR spectra could be collected from single neurons of dorsal root ganglia. The spatial resolution could be increased to the diffraction limit by using a synchrotron source. Very small, localized areas with a high concentration of ß-sheet secondary structures were detected in the scrapie-affected dorsal root ganglia by this method, hinting at the presence of PrPSc aggregates.

In this work, for the first time infrared (IR) microspectroscopy was successfully applied to the investigation of molecular aspects of transmissible spongiform encephalopathies. The microspectroscopic approach opens up the opportunity of direct and selective investigation of specific structures or substructures in the tissue. The knowledge about scrapie- specific molecular alterations obtained from the spectroscopic studies could provide a basis for the development of new methods for the rapid post mortem identification of infectious tissue.