Characterization of temperature-sensitive transient receptor potential channel melastatin 8 (TRPM8) in cultivated human ocular surface cells

Abstract

Background and aim: The dry eye syndrome (DES) is one of the most common ophthalmologic disorders worldwide. DES is often associated with Pterygium conjunctivae, a hyperproliferative and vascularized, benign conjunctival tumor. Hyperosmolarity of the tear film and increased activation of transient receptor potential channel vanilloid subtype 1 (TRPV1) are crucial pathogenetic factors in the development of inflammation on the ocular surface. TRPV1 is involved in thermal sensation, osmosensitivity and mediating inflammation. So far, treatment options only provide symptomatic relief by artificial tear substitution and topical anti-inflammatory drugs. Previous data indicate an inhibitory effect on TRPV1 channel mediated calcium-signaling via activation of another TRP channel (melastatin 8, TRPM8). Therefore, this thesis aims to further characterize these TRPs and the effects of known and novel modulators in connection with DES and pterygium. Methods: SV40-transfected immortalized human corneal epithelial cells (HCEC), human conjunctival epithelial cells (HCjEC) and primary cultivated human pterygium epithelial cells (hPtEC) were used as in vitro cell models. As heterologous TRPM8 transfection model, an osteosarcoma cell line (U2osTRPM8, B2) was used for transfected cells (TRPM8) and non-transfected controls (wild type). Changes in the intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) were investigated with fluorescence calcium imaging. The planar patch-clamp technique was employed to measure underlying whole-cell currents. Results: Physical cold stimulation (< 10 °C), application of menthol (500 µM), icilin (15 – 60 µM) as well as the novel endogenous thyroid hormone metabolite 3T1AM (thyronamine; 1 µM) increased [Ca2+]i and whole-cell current density in HCEC. This effect could be suppressed by the TRP channel blockers BCTC (10 – 20 µM) and lanthanum-III-chloride (La3+; 500 µM), respectively. 3T1AM and menthol also elicited calcium responses in TRPM8-transfected cells whereas non-transfected controls did not show any significant effect. Capsaicin (CAP; 20 µM) induced increases in whole-cell currents and calcium transients in HCEC. Notably, these responses were inhibited by pre-incubation with either icilin (15 µM) or 3T1AM (1 µM). In HCjEC, icilin (60 µM) induced reversible calcium transients. The calcium response to icilin (60 µM) in hPtEC differed significantly from HCjEC. Conclusions: This study demonstrates the functional expression of TRPM8 channels in HCEC, HCjEC and hPtEC for the first time. 3T1AM mediates its effects through TRPM8 channel activation. Furthermore, TRPM8 activation by the artificial cooling compound icilin or by a thyroid hormone derivative (3T1AM) inhibited TRPV1-linked calcium signaling pathways. Therefore, 3T1AM may be a possible new target in connection with the TRPs to develop an alternative treatment of DES.

Hintergrund und Zielsetzung: Das Syndrom des trockenen Auges (DES) ist eine der häufig-sten ophthalmologischen Erkrankungen weltweit. DES ist oftmals mit Pterygium conjunctivae assoziiert, einer benignen, vaskularisierten Bindehautwucherung. Ein hyperosmolarer Tränen-film und damit verbundene erhöhte Aktivierung des transient receptor potential channels vom Vanilloidsubtyp 1 (TRPV1) sind entscheidende Pathogenesefaktoren in der Entwicklung der Entzündung der Augenoberfläche. TRPV1 ist beteiligt an der Temperaturwahrnehmung, Osmo-sensitivität und Entzündungen. Die einzig verfügbare Therapie ist symptomatisch mit künstlichen Augentropfen und topischen anti-inflammatorischen Medikamenten. Vorangehende Studien zeigten einen inhibitorischen Effekt auf TRPV1-induzierte Kalziumströme durch die Aktivierung eines anderen TRP-Kanals (TRP melastatin 8 (TRPM8)). Diese Arbeit charakterisiert diese TRP-Kanäle sowie Effekte von bekannten und neuartigen TRP-Modulatoren in Verbindung mit DES und Pterygium. Methoden: SV40-transfizierte immortalisierte humane Korneaepithelzellen (HCEC), humane Konjunktivaepithelzellen (HCjEC) und primär kultivierte humane Epithelzellen von Patienten mit Pterygium conjunctivae (hPtEC) wurden als in vitro Zellmodelle verwendet. Weiterhin wurde eine TRPM8-transfizierte Osteosarkomzelllinie (U2osTRPM8, B2) und deren Wildtyp als heterologes Transfektionskontrollmodell verwendet. Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration ([Ca2+]i) wurde mit Fluoreszenz-Ca2+-Imaging untersucht. Planares Patch-Clamping wurde verwendet, um Ganzzellströme zu messen. Ergebnisse: Physikalische Kühlung (< 10 °C), Menthol (500 µM), Icilin (15 – 60 µM) sowie der neuartige endogene Schilddrüsenhormonmetabolit 3T1AM (Thyronamine; 1 µM) erhöhten die [Ca2+]i und die Ganzzellstromdichte in HCEC. Dieser Effekt konnte durch die TRP-Kanalblocker BCTC (10 – 20 µM) und Lanthanum-III-Chlorid (La3+; 500 µM) unterdrückt werden. 3T1AM und Menthol führten ebenfalls in TRPM8-transfizierten Zellen zu messbaren Kalziumeinströmen, wohingegen in nicht-transfizierten Zellen kein Effekt messbar war. Auch Capsaicin (CAP; TRPV1 Agonist; 20 µM) induzierte Ganzzellströme und Kalziumeinströme in HCEC. Diese konnten durch Präinkubation mit entweder Icilin (15 µM) oder 3T1AM (1 µM) geblockt werden. In HCjEC induzierte Icilin (60 µM) reversible Kalziumeinströme. Diese unterschieden sich signifikant von denen, die Icilin (60 µM) in hPtEC auslöste. Zusammenfassung: Die vorliegende Studie zeigt erstmals die funktionale Expression von TRPM8 in HCEC, HCjEC sowie hPtEC. 3T1AM aktiviert TRPM8. TRPM8-Aktivierung durch Icilin oder 3T1AM inhibiert die TRPV1-vermittelte Kalziumsignalkaskade. Deshalb stellt 3T1AM in Verbindung mit TRP-Kanälen eine mögliche neue Therapieoption bei DES dar.