Generation of new GPCR-antibodies for target validation in tumor diagnosis and therapy

Abstract

Early diagnosis and detection of small tumors and metastases are crucial for successful cancer therapy. A very promising approach for sensitive tumor imaging and therapy is the use of G protein-coupled receptors (GPCRs) overexpressed on tumors as targets for contrast agent- or radioisotope- labelled ligands. To validate new GPCR targets, new antibodies were needed to investigate expression of GPCRs in normal and cancerous human tissue of the gastrointestinal tract. To investigate the potential of chemokine-like receptor 1 (CMKLR1) as a tumor target, two polyclonal antibodies in rabbits were generated, one recognizing an extracellular and the other an intracellular epitope on CMKLR1. Successful validation of these antibodies in in vitro systems demonstrated clear specificity for CMKLR1. Therefore, they were used to investigate human tissue samples for expression of CMKLR1, which has been shown to be expressed on immune cells and adipocytes so far. In normal tissue, CMKLR1 was found to be expressed in the epithelium of the tonsil and the esophagus, as well as in alpha-cells of the pancreas and some not further characterized cells of the antrum, small intestine, colon, prostate and kidney. In cancerous tissue, CMKLR1 was found to be expressed in 50 % of pancreatic carcinomas and strongly overexpressed in 50 % of esophageal squamous cell carcinomas (ESCCs) but not in esophageal adenocarcinomas, islet cell carcinomas, insulinomas, hepatocellular carcinomas, nor in neuroendocrine tumors. Consequently, the cancer cell lines Kyse 180, Kyse 520 and OE 21, all derived from ESCCs, were also found to express CMKLR1. These results demonstrate that CMKLR1 is a promising target for imaging and therapy of ESCCs and may be also for pancreatic carcinomas. To investigate the potential of cholecystokinin type 1 receptor (CCK1R) for tumor imaging, a monoclonal antibody was generated in mice with recombinantly expressed and purified antigen derived from CCK1R. After successful validation in in vitro systems, expression of CCK1R in gastrointestinal tissues was investigated. In normal tissue, CCK1R expression was found all along the smooth muscles of the digestive tract, including stomach, small and large bowel, gallbladder, caecum and sigmoid. This is in accordance with the physiological functions of the ligand cholecystokinin which is known to influence bowel motility and gallbladder contraction. Furthermore, CCK1R expression was found in one third of ileal neuroendocrine tumors but not in pancreatic neuroendocrine tumors nor esophageal tumors. These results outline the possibility for the use of CCK1R as a target for endoscopic optical imaging of a subset of ileal neuroendocrine tumors. Finally, two more monoclonal antibodies, one specific for the secretin receptor (SCTR) and the other specific for glucagon-like peptide-2 receptor (GLP-2R) were generated by immunizing mice with recombinantly produced antigens, and successfully validated in in vitro systems.

Die frühe Diagnose sowie die Detektion von kleinen Tumoren und Metastasen ist häufig entscheidend für eine erfolgreiche Therapie einer Krebserkrankung. Ein vielversprechender Ansatz für eine gerichtete Bildgebung und Therapie ist die Verwendung von auf Tumoren überexprimierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) als Zielstrukturen für Kontrastmittel- oder Radioisotopen-gekoppelte Liganden. Um das Potenzial des Chemerin-Rezeptors (CMKLR1) als Zielstruktur zu untersuchen, wurden zwei polyklonale Antikörper im Kaninchen hergestellt. Durch intensive Validierungen in in vitro Systemen konnte gezeigt werden, dass beide Antikörper spezifisch CMKLR1 binden. Mit diesen validierten Antikörpern wurde humanes Normal- und Tumorgewebe auf die Expression von CMKLR1 untersucht. In Normalgewebe konnte die Expression von CMKLR1 im Plattenepithel von Tonsille und Ösophagus gezeigt werden, in den A-Zellen des Pankreas sowie in vereinzelten Zellen der Submukosa des Dünn- und Dickdarms. Außerdem konnte gezeigt werden, daß 50 % der pankreatischen Karzinome CMKLR1 exprimieren und 50% der Plattenepithelkarzinome des Ösophagus CMKLR1 sogar stark überexprimieren. Auch in den drei humanen ösophagealen Plattenepithelkarzinomen-Zelllinien Kyse 180, Kyse 520 und OE 21 konnte eine Expression von CMKLR1 gezeigt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass CMKLR1 eine vielversprechende Zielstruktur für die gerichtete Bildgebung und Therapie von Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus sowie von pankreatischen Karzinomen darstellt. Um das Potenzial des Cholezystokinin-Typ-1-Rezeptors (CCK1R) als Zielstruktur zu untersuchen, wurde ein monoklonaler Antikörper in der Maus hergestellt. Zur Immunisierung wurde eine rekombinant exprimierte und aufgereinigte intrazelluläre Domäne des CCK1R als Antigen verwendet. Nach erfolgreicher Validierung in in vitro Systemen wurde die Expression von CCK1R in gastrointestinalen Geweben untersucht. In Normalgewebe konnte gezeigt werden, dass CCK1R in der gesamten glatten Muskulatur des Magen-Darm-Trakts inklusive der Gallenblase exprimiert wird. Dieses Expressionsmuster unterstützt die gängige Ansicht, dass der CCK1R-Ligand Cholezystokinin für die Kontraktion der Gallenblase verantwortlich ist und die Bewegung des Darms beeinflusst. Außerdem konnte gezeigt werden, dass ein Drittel der ilealen neuroendokrinen Tumore CCK1R exprimieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass CCK1R eine mögliche Zielstruktur für die Tumorbildgebung ilealer neuroendokriner Tumoren in der fluoreszenzunterstützten Chirurgie oder in der fluoreszenzunterstützten Endoskopie darstellt. Des Weiteren wurden zwei monoklonale Antikörper spezifisch für den Sekretin-Rezeptor und den Glukagon- like-Peptide-2-Rezeptor hergestellt. Zur Immunisierung wurden rekombinant exprimierte und aufgereinigte N-Termini der Rezeptoren als Antigene verwendet. Diese beiden Antikörper wurden ebenfalls erfolgreich validiert und können nun zur Validierung der beiden Rezeptoren als mögliche Zielstrukturen eingesetzt werden.