Doxorubicin fails to eradicate cancer stem cells derived from anaplastic thyroid carcinoma cells: characterization of resistant cells

Abstract

Current chemotherapy with doxorubicin fails to eradicate anaplastic thyroid cancer or even to stop tumour progress. It is hypothesized that cancer initiation, progression and metastasis are driven by a small population of cancer stem cells (CSCs), which are also responsible for drug resistance. The aim of the present work was (1) to identify whether the putative cancer stem cells exist in anaplastic thyroid carcinoma cells, (2) to generate stable doxorubicin resistant anaplastic thyroid carcinoma cell line, (3) to prove whether or not drug resistance is partly due to cancer stem cells which could expel chemotherapeutic drugs and (4) to detect whether the ABC transporter inhibitors can reverse drug resistance. To test these hypotheses, anaplastic thyroid cell lines were characterized by FACS for their content of cancer stem cells, their in vitro sphere-forming capacity and their expression of multidrug resistance transporters of the ABC gene family which may confer drug resistance to the cells. Cells were treated with doxorubicin in short-term and long-term culture up to 6 months to establish a resistant cell line. The survival of cancer and cancer stem cells and the differential expression of transporters were analyzed. This work demonstrated that anaplastic thyroid cancer cell lines (C643/ HTh74/ SW1736) consisted of 0.2 – 0.6 % side population (SP) cells, which enabled the exclusion of the Hoechst dye that otherwise binds to the DNA in the major fraction of non-SP cells. SP cells highly expressed stem cell marker Oct4 and ABCG2 and multi-drug-resistant 1 (MDR1) transporters of the ABC gene family which were characterized as cancer stem cells. HTh74 anaplastic thyroid cancer cells were treated with doxorubicin in short-term and long-term culture up to 6 months to establish a resistant cell line, designated HTh74R. The survival of cancer and cancer stem cells and the differential expression of transporters were analyzed. Treatment with doxorubicin killed the large majority of cancer cells derived from anaplastic thyroid carcinoma cell lines. This conferred a growth advantage to cancer stem cells which in turn overgrew the culture. HTh74R cells consisted of about 70% SP cells, expressed high levels of ABCG2, MDR1 and Oct4 and were more clonogenic than HTh74 wild type cells. Inhibitors of ABCG2 and/or MDR1 (verapamil and fumitremorgin C) sensitized HTh74R to doxorubicin. They potentiated the doxorubicin-induced apoptosis by activating the caspase- dependent pathway in resistant anaplastic thyroid carcinoma cells and thus partly resolved drug resistance. In conclusion, the present work suggests that the failure of doxorubicin to eradicate all anaplastic thyroid carcinoma cells is mainly due to resistance of CSCs to the chemotherapeutic drug although there is a smaller fraction of resistant cells that do not express drug- exporting ABC transporters. ABC transporter inhibitors can sensitize the effect of doxorubicin to resistant cells, which is mediated by a caspase- dependent pathway. Further therapeutic strategies have to be developed that target not only the main population of cancer cells but also to eradicate CSCs that are responsible for tumour progression and recurrence.

Die gegenwärtig in der Behandlung des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms empfohlene Chemotherapie mit Doxorubicin führt weder zu einer ausreichenden Zerstörung der Tumormasse noch kann sie die Tumorprogression aufhalten. Nach einer mittlerweile weitverbreiteten Hypothese ist die Tumorentstehung, die Wachstumsprogression und die Metastasierung auf eine kleine Population von sogenannten Karzinomstammzellen (CSCs, cancer stem cells) zurückzuführen, die auch für die Chemotherapeutika – Resistenz verantwortlich sind. Das Ziel der gegenwärtigen Arbeit war (1) mögliche Karzinomstammzellen in anaplastischen Schilddrüsenkarzinomen zu identifizieren und zu charakterisieren, (2) eine stabile Doxorubicin-resistente anaplastische Schilddrüsencarcinom-Zelllinie herzustellen, (3) zu analysieren, ob Karzinomstammzellen Chemotherapeutika aus der Zelle ausschleusen können und daher für Chemotherapieresistenz in diesen Karzinomzellen verantwortlich sind und (4) zu untersuchen, ob Hemmer der ABC- Transporter die Chemotherapieresistenz rückgängig machen können. Diese Arbeit wies nach, dass anaplastische Schilddrüsenkarzinomzelllinien (C643 / HTh74/ SW1736) 0,2 – 0,6 % sogenannter side population - Zellen aufweisen, die die Ausschleusung des Hoechst Farbstoffes aus CSC ermöglichen, während bei nicht- CSC- Zellen der Farbstoff an die DNA bindet. HTh74 side population-Zellen exprimierten den Stammzellmarker Oct4 und ABCG2 und multiple drug resistance 1 (MDR1)-Transporter der ABC Gene-Familie. HTh74 - Zellen wurden mit Doxorubicin in einer Kurzzeit- und einer Langzeitkultur bis zu 6 Monaten behandelt mit dem Ziel einer Etablierung einer resistenten Zelllinie HTh74R. Das Überleben der Karzinom – und Karzinomstammzellen und die differentielle Expression der Transporter wurden analysiert. Die Behandlung mit Doxorubicin zerstörte die große Mehrheit von Karzinomzellen der anaplastischen Schilddrüsenkarzinomzelllinien. In der Folge kam es zu einem Wachstumsvorteil der Karzinomstammzellen, die die Kultur überwuchsen. HTh74R – Zellen bestanden aus etwa 70% side population - Zellen, die eine höhere Expression von ABCG2, MDR1 und Oct4 und ein ausgeprägteres klonales Wachstum im Vergleich zu HTh74 – Zellen aufwiesen. Hemmstoffe der ABCG2- und/oder MDR1 – Transporter (Verapamil und Fumitremorgin C) machten die resistenten HTh74R – Zellen wieder empfindlich gegenüber Doxorubicin und verminderten so deren Resistenz. Verapamil potenzierte die durch Doxorubicin induzierte Apoptose über eine Aktivierung caspase - abhängiger Stoffwechselwege in den resistenten anaplastischen Schilddrüsenkarzinomzellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die unzureichende chemotherapeutische Wirkung von Doxorubicin bei anaplastischen Schilddrüsenkarzinomzellen im Wesentlichen auf eine Resistenz von Karzinomstammzellen zurückzuführen ist, wobei eingeschränkt gesagt werden muss, dass eine kleinere Anzahl resistenter Zellen die Chemotherapeutika – exportierenden ABC - Transporter nicht exprimierten. Hemmstoffe der ABC - Transporter führen folglich dazu, dass Doxorubicin in den resistenten Zellen wieder wirksam wurde. Dieser Effekt wird im Wesentlichen über den caspase - abhängigen Stoffwechselweg vermittelt. Künftige therapeutische Strategien müssen darauf zielen, nicht nur die Hauptpopulation der Karzinomzelllinien sondern auch die Karzinomstammzellen zu vernichten, die für die Tumorprogression und für die Rezidive verantwortlich sind.