Characterization of an associated protein kinase of the BMP type II receptor

Abstract

Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) regulate a plethora of cellular processes as proliferation, differentiation, chemotaxis and apoptosis in embryonic and mature tissue. The transduction of BMP signals is strictly regulated at each step of the signaling cascade. The importance of this precise regulation is reflected by developmental disorders and dysfunctions in humans such as bone and cartilage diseases or cancer, which appear when specific components of the BMP pathway are defective. BMP ligands bind to a set of two specific transmembrane serine/threonine kinase receptors, the BMP type I receptor (BRI) and the BMP type II receptor (BRII). These receptors prior to ligand binding either reside preassembled in heteromeric preformed complexes (PFCs) in the cell membrane or exist as monomers or homodimers. Ligand binding to PFCs triggers transphosphorylation of BRI by BRII and propagation of the signal by phosphorylation and concomitant activation of R-Smad1/5/8. The signal is then transduced via heteromeric complexes of R-Smad1/5/8 and co-Smad4 and subsequent translocation into the nucleus to regulate BMP-specific target gene expression. Non-Smad signaling, however, is initiated by binding of BMP-2 to the high affinity receptor BRI, which subsequently recruites BRII into a BMP- induced signaling complex (BISC) to activate MAPK pathways. Mutations within BRII are implicated in the development of pulmonary arterial hypertension (PAH). PAH is characterized by narrowing of the pulmonary artery due to abnormal cell proliferation resulting in elevated blood preassure and heart failure. Several proteins have been shown to bind to BRII regulating BMP signaling initiated by the receptor complex. Although some of these interaction partners seem to interfere with the pathogenesis of PAH, the role of BRII and its crosstalk mechanisms inside PAH are still unclear. In the presented work, the impact of the cGMP-dependent kinase I (cGKI) on BRII and thus on BMP signaling was investigated. Using a proteomics-based approach, cGKI was identified to bind to BRII. So far, no function has been assigned to cGKI in BMP signaling. cGKI is a soluble cytoplasmic serine/threonine kinase and one of the major mediators in nitric oxide (NO)/cyclic guanosine 3',5'- monophosphate (cGMP)-triggered signal transduction. The kinase plays a pivotal role in many physiological processes such as vascular tone control, platelet activation and synaptic plasticity. It is highly expressed in vascular smooth muscle cells (VSMCs), where it regulates gene expression, morphology and proliferation. Alterations of cGKI expression and activity are involved in the pathogenesis of hypertension, atherosclerosis, restenosis, and hyperlipemia. In this thesis, it is shown that cGKI directly interacts with and phosphorylates BRII which likely results in activation of the receptor complex. Consistent with this, cGKI enhances the BMP-2-mediated Smad1/5/8 phosphorylation at the C-terminus and thus R-Smad function. Upon BMP-2 stimulation, cGKI is released from the receptor to bind to R-Smad1/5/8 as well as to co-Smad4. BMP-2-dependently, these complexes translocate into the nucleus, and bind to the promoter of the BMP target gene Id1. At the promoter, the general transcription factor TFII-I, which is a known substrate for cGKI, is recruited by the kinase to further enhance BMP signaling. In sum, this thesis demonstrates a dual role for cGKI in BMP signaling through (1) regulating BMP receptor and R-Smad activation at the plasma membrane, and through (2) regulating expression of BMP target genes in the nucleus. In addition, this study supposes that defective cellular responses induced by mutant BRII underlying in patients with PAH can be compensated by cGKI expression. Thus, the characterized cGKI crosstalk with BMP signaling not only expands the functional flexibility of the cGMP/cGKI pathway, but also opens new prospects for investigation of a BMP/cGKI/Smad pathway and treatment of vascular diseases.

Bone morphogenetic proteins (BMPs) regulieren sowohl in embryonalen als auch adulten Geweben eine Vielzahl von zellulären Prozessen wie Proliferation, Differenzierung, Chemotaxis und Apoptose. Jeder einzelne Schritt der Weiterleitung von BMP-Signalen unterliegt einer strengen Kontrolle. Im Menschen können Mutationen einzelner Komponenten dieses Signalweges unter anderem fehlerhafte Knochen- und Knorpelentwicklung oder Krebs induzieren, wodurch sich die Wichtigkeit dieser genauen Regulation widerspiegelt. Der BMP- Ligand bindet an zwei spezifische, transmembrane Serin/Threonin Kinase- Rezeptoren, den BMP Typ I Rezeptor (BRI) und Typ II Rezeptor (BRII). Vor Ligandenbindung sind diese membranständigen Rezeptoren entweder bereits komplexiert (präformierte Komplexe, PFCs) oder liegen als Monomere oder Homodimere vor. Ligandenbindung an den präformierten Komplex löst die BRI- Transphosphorylierung durch BRII aus und führt zur Signalweitergabe durch Phosphorylierung und Aktivierung der Rezeptor-regulierten R-Smads1/5/8. Durch Komplexbildung zwischen phosphorylierten R-Smads und co-Smad4 und anschliessender nukleärer Migration, wird das Signal zur Regulierung von BMP- spezifischen Zielgenen in den Zellkern weitergeleitet. Smad-unabhängige BMP- Signaltransduktion hingegen wird durch BMP-2-Bindung an den hochaffinen BRI eingeleitet, der darauffolgend BRII in den BMP-induzierten Signalkomplex (BISC) rekrutiert, um MAPK-Signalwege zu aktivieren. Mutationen in BRII können pulmonäre arterielle Hypertonie (PAH) auslösen. PAH zeichnet sich durch Verengung der pulmonalen Arterie durch Hyperproliferation von Zellen aus. Dies resultiert in Bluthochdruck und Herzinsuffizienz. Für mehrere Proteine wurde bereits eine Assoziation mit BRII identifiziert, die die Rezeptor-induzierte BMP-Signaltransduktion regulieren. Obwohl einige dieser Interaktionspartner die Pathogenese von PAH scheinbar beeinflussen, ist die Rolle von BRII und BRII-initiiertem Crosstalk bezüglich PAH dennoch unklar. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der cGMP-abhängigen Porteinkinase I (cGKI) auf BRII und somit auf die BMP-Signalgebung untersucht. Mit Hilfe eines experimentellen Ansatzes, der auf Proteom-Analyse basiert, konnte cGKI als ein BRII- assoziiertes Protein identifiziert werden. Bis dato wurde keine Funktion von cGKI innerhalb der BMP-Signaltransduktion beschrieben. Die Serin/Threonin- spezifische Kinase ist einer der wichtigsten Mediatoren der durch Stickstoffmonoxid (NO) und zyklischem Guanosin 3',5'-Monophosphat (cGMP) ausgelösten Signalkaskade. cGKI spielt eine zentrale Rolle in vielen physiologischen Prozessen wie Kontrolle des Gefässtonus und der synaptischen Plastizität sowie in der Regulation der Aggregation von Blutplättchen. Die Kinase wird stark in Zellen der glatten vaskulären Muskulatur exprimiert, in denen sie Genexpression, Zellmorphologie und Proliferation reguliert. Veränderung der cGKI-Expression und -Aktivität werden mit der Pathogenese von Hypertonie, Atherosklerose, Restenose und Hyperlipemie in Verbindung gebracht. Durch dieser Promotionsarbeit kann gezeigt werden, dass cGKI direkt mit BRII assoziiert und den Rezeptor phosphoryliert. Diese Modifikation führt sehr wahrscheinlich zur Aktivierung des Rezeptorkomplexes. Mit diesem Ergebnis vereinbar ist die cGKI-vermittelte Steigerung der Smad1/5/8-Phosphorylierung nach BMP-2-Stimulation. Behandlung mit dem BMP-2-Liganden führt desweiteren zur Dissoziation von cGKI von BRII. Gleichzeitig kommt es zur verstärkten Komplexbildung von cGKI mit R-Smads und co-Smad4. In Abhängigkeit von BMP-2 wandert dieser Proteinkomplex in den Zellkern, um an spezifische Genpromotoren zu binden. Der Transkriptionsfaktor TFII-I, der ein bekanntes cGKI-Substrat darstellt, wird durch die Kinase an den Id1-Promotor rekrutiert, um eine weitere Steigerung der BMP-Genantwort zu erzielen. Zusammenfassend wird innerhalb dieser Promotionsschrift eine duale Rolle von cGKI innerhalb der BMP-Signaltransduktion demonstriert: cGKI reguliert (1) die Aktivierung von BMP-Rezeptoren und R-Smads an der Plasmamembran und (2) die Expression von BMP-Zielgenen im Zellkern. Zusätzlich lassen die Ergebnisse der vorliegenden Studie die Schlussfolgerung zu, dass fehlerhafte zelluläre Antworten, die durch PAH-BRII-Mutanten ausgelöst werden, durch Expression von cGKI kompensiert werden können. Somit erweitert der beschriebene Crosstalk von cGKI zur BMP-Signaltransduktion nicht nur die funktionelle Flexibilität des cGMP /cGKI-Signalweges, sondern eröffnet auch neue Perspektiven zur Erfoschung einer BMP/cGKI/Smad-Kaskade und für die Behandlung von Gefässkrankheiten.