Tumorspezifische chimäre Toxine: Konstruktion, biochemische Charakterisierung und Analyse ihrer therapeutischen Bedeutung

Abstract

In den letzten Jahren wurden vielfach neue Medikamente entwickelt, die konventionelle Behandlungsmethoden von Krebserkrankungen verbessern. Diese verwenden oft Antikörper für eine spezifische Erkennung von Oberflächenstrukturen, die auf Tumorzellen überexprimiert werden. Während durch die Anwendung von Antikörpern bereits beachtliche Verbesserungen in den Therapiemöglichkeiten erreicht wurden, werden weitere vielversprechende Untersuchungen zu kombinierten Wirkstoffen vorangetrieben. Durch Kombination von Antikörpern oder Wachstumsfaktoren mit toxischen Substanzen entstehen Immunotoxine oder chimäre Toxine, die nach spezifischer Bindung eine Aufnahme der Toxine in die Tumorzelle vermitteln, wodurch die Zelle stirbt. Damit kann die Behandlung von Krebs durch spezifische Wirkstoffe erheblich verbessert werden, während gleichzeitig Nebenwirkungen minimiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden chimäre Toxine entwickelt und charakterisiert, bei denen das Toxin mit dem Liganden über einen spaltbaren Adapter verbunden ist. Der Adapter dient der Senkung von Nebenwirkungen und der Verbesserung der Toxinaufnahme. Zur Analyse von chimären Toxinen mit Diphtheriatoxin wurde ein colorimetrischer Festphasenassay entwickelt, der eine quantitative Analyse der Enzymaktivität in vitro erlaubt und durch seine Flexibilität und hohe Sensitivität auch zur Diagnose von Patientenproben mit Diphtherieverdacht hervorragend geeignet ist. Die Analyse von drei chimären Toxinen, die jeweils Liganden für den Interleukin-2 Rezeptor tragen, zeigte zwar Enzymaktivität der Toxine, jedoch keine Cytotoxizität und Bindung an Interleukin-2 Rezeptor exprimierende Zellen. Wahrscheinlich ist die für diese chimären Toxine gewählte Kombination von Toxin und Ligand zur Ausbildung aktiver chimärer Toxine durch sterische Effekte nicht geeignet. Um die Verbesserung der Toxinaufnahme durch den Adapter in den chimären Toxinen weiter zu charakterisieren, wurden innerhalb des Adapters sechs unterschiedliche Membrantransferpeptide verwendet, für die eine Vermittlung der Wirkstoffaufnahme beschrieben wurde. Für diese Analysen wurden chimäre Toxine mit epidermal growth factor als Ligand verwendet. Die Einführung der unterschiedlichen Membrantransferpeptide in die chimären Toxine ergab in Cytotoxizitätsassays und Bindungsstudien keine erhöhte Aufnahme, jedoch konnte für einen Teil der Sequenzen eine gesteigerte unspezifische Bindung an Zellen beschrieben werden, weshalb sie sich für die Verwendung in tumorspezifischen Wirkstoffen nicht eignen. Mit dem Ziel, die Wirksamkeit der chimären Toxine zu verbessern, wurde die Steigerung der Cytotoxizität durch Kombination Saponinen charakterisiert. Alle sieben verwendeten Saponine konnten in einem synergistischen Prozess die Cytotoxiztität erhöhen, jedoch konnten nur Quillajasaponin und Saponinum album die Wirkung mehr als 10fach steigern. Saponinum album erhöhte die Cytotoxizität sogar 13600fach. Saponinum album erhöhte dabei gezielt die Ligand abhängige und damit spezifische Cytotoxizität, während die Ligand unabhängige, unspezifische Cytotoxizität nur wenig beeinflusst wurde. Damit bietet sich Saponinum album als Zusatz für spezifische Tumorwirkstoffe in Maus-Tumormodellen an, da durch die Kombination mit Saponinen das therapeutische Fenster erweitert wird und tumorspezifische Wirkungen gesteigert und Nebenwirkungen gesenkt werden.

Mutation-based, uncontrolled growth of cells leads to cancer. Several innovative new treatments have been developed in the recent years to improve conventional cancer treatments. These biological treatments are based on the use of antibodies or growth factors for specific binding to over-expressed tumor-specific structures on the cell surface. Treatment with antibodies in cancer therapies is promising, but the development of new drugs is ongoing. By conjugating antibodies or growth factors to toxic substances, immunotoxins or chimeric toxins have been developed. These conjugates are able to bind specifically to tumor cells and the resulting uptake of the toxin causes cell death. Thus, immunotoxins or chimeric toxins can be designed to treat specific cancer types as well as reducing side effects on healthy cells. In the present study chimeric toxins with a molecular adapter linking the toxin and the ligand were generated and characterized. The adapter has been developed to reduce side effects and to improve the uptake of the toxins into cells. A new colorimetric solid phase assay has been established to determine the enzymatic activity of chimeric toxins composed of diphtheria toxin or pseudomonas exotoxin. This colorimetric solid phase assay permits quantitative examinations in vitro and its enhanced sensitivity enables it for use in diagnostics. The analyses of three chimeric toxins composed of diphtheria toxin A-chain and ligands for interleukin-2 receptor showed the enzymatic activity of diphtheria toxin but failed to elicit cytotoxicity. The combination of diphtheria toxin A-chain with the ligands probably produced a sterical effect that prevents the ligand binding to interleukin-2 receptor expressing cells. Six different membrane transfer peptides within the adapter of chimeric toxins targeting the epidermal growth factor receptor were used to characterize the adapter-mediated improvement of toxin uptake into cells. The investigations of the chimeric toxins in cytotoxicity assays and binding studies revealed no increased uptake of the toxins into cells regardless of the membrane transfer peptide used. However, some of the sequences showed higher nonspecific binding to cells. This result demonstrates that these sequences are not suitable for use in tumor-specific drugs. To further enhance the efficacy of chimeric toxins the combination with saponins, plant steroidal or triterpenoidal glycosides, was characterized. All seven analysed saponins caused higher cytotoxicity in a synergistic process, but only Quillajasaponin and Saponinum album elicited a more than 10-fold enhancing effect on cytotoxicity. Saponinum album even caused a 13600-fold higher cytotoxicity of the chimeric toxin. Furthermore, its enhancement of cytotoxicity is dependent on receptor-ligand interactions. Saponinum album is thus a suitable additive for tumor therapies with specific drugs in mouse tumor models. The combination of saponins and tumor-specific compounds increases the prospect for therapeutic treatments, as tumor-specific compounds will have increased cytotoxicity and fewer side effects.