Towards vaccines and therapeutic antibodies against Clostridium difficile based on synthetic glycans

Abstract

Clostridium difficile is a leading cause of infectious diarrhea and mortality worldwide. Emerging antibiotic resistance has fostered studies on toxin- neutralizing vaccines and therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) that limit symptoms but not intestinal colonization by C. difficile. Bacterial surface glycans are promising targets for colonization-inhibiting vaccines but are weakly and inconsistently expressed by C. difficile in vitro. Their study has recently been facilitated by chemically synthesized glycans. This thesis describes detailed immunological examinations of synthetic glycans of C. difficile polysaccharide-I (PS-I) and lipoteichoic acid (LTA) en route towards novel vaccines and therapeutic mAbs. Efforts to ascertain the vaccine potential of the PS-I pentasaccharide repeat unit are described in Section 1.1. Microarray-assisted screening of clinical specimens revealed a correlation of pentasaccharide-specific antibody levels with reduced symptoms of C. difficile disease, indicative of protective effects. The pentasaccharide elicited T cell-dependent antibody responses in mice when formulated as glycoconjugate with the CRM197 protein. Anti-pentasaccharide antibodies localized to the intestine in vivo and bound to C. difficile bacteria in vitro. Vaccination with the glycoconjugate significantly protected mice from experimental C. difficile infection. Section 1.2 describes the identification of a minimal epitope of PS-I. A disaccharide of rhamnose and glucose emerged as the smallest epitope recognized by pentasaccharide-raised murine antibodies, as shown by microarray and surface plasmon resonance (SPR). When formulated as CRM197 glycoconjugate, the disaccharide elicited antibodies of comparable quality as the pentasaccharide did. This provided a crucial step towards anti-clostridial vaccines with limited synthetic effort. In Section 1.3, the generation and analysis of anti-PS-I mAbs is described. They were obtained via the hybdridoma technique from mice immunized with the pentasaccharide-CRM197 glycoconjugate. SPR studies demonstrated nanomolar affinity binding to the pentasaccharide and low-affinity recognition of the disaccharide. Isothermal titration calorimetry revealed that enhanced binding to the pentasaccharide was the result of an entropic gain likely mediated by hydrophobic interactions with rhamnoses. The mAbs recognized C. difficile and could protect mice from bacterial disease. Section 1.4 focuses on efforts towards a fully synthetic vaccine based on oligovalent PS-I disaccharides. Insights gained from glycan-antibody interaction studies allowed for the rational design of a PS-I glycan mimetic intended to elicit protective antibodies. Five disaccharides presented on a synthetic scaffold were highly antigenic and bound by antibodies with five orders of magnitude stronger avidity than monovalent glycans, as shown by SPR. Equipped with a CRM197 T cell epitope, the fully synthetic vaccine candidate elicited antibodies highly specific for the PS-I pentasaccharide in mice. These findings provided proof-of- concept that immunological properties of larger glycans can be resembled by oligovalent display of minimal epitopes. Section 1.5 describes studies on the vaccine potential of synthetic LTA oligomers. Microarray-assisted screening of patient-derived sera showed that synthetic LTA glycans represent natural epitopes that are likely immunogenic during C. difficile infection. Based on these findings, a CRM197 glycoconjugate displaying a tetrasaccharide of LTA was synthesized that was immunogenic in mice. In vivo challenge studies demonstrated that vaccination with the LTA glycoconjugate could significantly protect mice from C. difficile colonization. In conclusion, this study shows that synthetic PS-I and LTA glycans are promising antigens for colonization- inhibiting vaccines and therapeutic antibodies against C. difficile.

Clostridium difficile ist weltweit eine Hauptursache infektiöser Diarrhö und Sterblichkeit. Antibiotikaresistenzen führten zur Untersuchung gegen bakterielle Toxine gerichteter Impfstoffe und monoklonaler Antikörper. Diese lindern Symptome, verhindern aber nicht die intestinale Besiedlung durch C. difficile. Bakterielle Oberflächenglykane sind vielversprechende Angriffspunkte für Besiedlungs-inhibierende Impfstoffe, werden vom Erreger in vitro jedoch nur schwach produziert. Ihre Untersuchung wurde kürzlich durch chemisch synthetisierte Glykane vereinfacht. Diese Arbeit beschreibt immunologische Untersuchungen synthetischer Glykane des C. difficile Polysaccharids PS-I und Lipoteichonsäure (LTA), welche zu neuen Impfstoffen und therapeutischen Antikörpern führen können. Arbeiten hinsichtlich des Impfstoffpotenzials der Pentasaccharid-Wiederholungseinheit von PS-I sind in Abschnitt 1.1 beschrieben. Mikroarray-basierte Screenings klinischer Proben zeigten eine Korrelation Pentasaccharid-spezifischer Antikörper mit schwächeren Symptomen, was auf eine Schutzwirkung hindeutet. Das Pentasaccharid erzeugte T-Zell- abhängige Antikörperantworten in Mäusen, wenn dieses als Glykokonjugat mit dem CRM197-Protein formuliert wurde. Anti-Pentasaccharid-Antikörper wurden in vivo in den Intestinaltrakt transportiert und banden an C. diffcile in vitro. Impfung mit dem Glykokonjugat schützte Mäuse signifikant vor signifikant vor experimenteller C. difficile-Infektion. Abschnitt 1.2 beschreibt die Identifizierung eines minimalen Epitops von PS-I. Ein Disaccharid aus Rhamnose und Glukose wurde mittels Mikroarray und Oberflächenplasmonresonanzspetroskopie (SPR)-Messungen als kleinstes Epitop, das von Pentasaccharid-erzeugten Mausantikörpern erkannt wird, identifiziert. Das als CRM197-Glykokonjugat formulierte Disaccharid erzeugte in Mäusen Antikörper, die denen gegen das Pentasaccharid ähnelten. Dies ist ein wichtiger Schritt hinsichtlich der Entwicklung von Impfstoffen mit limitiertem synthetischen Aufwand. Abschnitt 1.3 umfasst die Erzeugung und Analyse monoklonaler Antikörper gegen PS-I, die durch die Hybridom-Technik aus mit Pentasaccharid-CRM197-Glykokonjugat immunisierten Mäusen erhalten wurden. SPR-Studien zeigten, dass die Antikörper mit nanomolarer Affinität das Pentasaccharid und mit niedrigerer Affinität das Disaccharid erkennen. Isothermale Titrationskalorimetrie-Messungen ließen eine entropisch bevorzugt Bindung an das Pentasaccharid erkennen, vermutlich erzeugt durch hydrophobe Interaktionen mit Rhamnosen. Die Antikörper erkannten C. difficile und schützten Mäuse vor bakterieller Krankheit. Abschnitt 1.4 legt den Fokus auf Bestrebungen in Richtung eines komplett synthetischen Impfstoffs basierend auf oligovalenten PS-I-Disacchariden. Durch Glykan- Antikörper-Interaktionsstudien gewonnene Einblicke ermöglichten das rationale Design von PS-I-Glykanmimetika, welche protektive Antikörper hervorrufen sollen. SPR-Studien zeigten, dass fünf auf einem synthetischen Träger präsentierte Disaccharide stark antigen wirksam waren und von Antikörpern mit fünf Größenordnungen stärkerer Avidität als monovalente Glykane gebunden wurden. Mit einem CRM197-T-Zell-Epitop versehen erzeugte der komplett synthetische Impfstoffkandidat in Mäusen Antikörper mit hoher Spezifität gegen das Pentasaccharid. Dies lieferte den Machbarkeitsnachweis, dass immunologische Eigenschaften größerer Glykane durch oligovalente Präsentation minimaler Epitope nachgeahmt werden können. Abschnitt 1.5 beschreibt Studien hinsichtlich des Impfstoffpotenzials synthetischer LTA-Oligomere. Mikroarray- basiertes Screening von Patientenseren zeigte, dass synthetische LTA-Glykane natürlichen Epitopen entsprechen, die vermutlich während der C. difficile- Infektion immunogen wirksam sind. Basierend darauf wurde ein CRM197-Glykokonjugat mit einem LTA-Tetrasaccharid synthetisiert, das in Mäusen immunogen war. In vivo-Infektionsversuche zeigten, dass eine Impfung mit dem LTA-Glykokonjugat die C. difficile-Besiedlung in Mäusen signifikant verminderte. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass synthetische PS-I- und LTA-Glykane vielversprechende Antigene für Besiedlungs-inhibierende Impfstoffe und therapeutische Antikörper gegen C. difficile sind.