Interaction of Ihh/Pthlh, BMP and FGF signaling in regulating chondrocyte proliferation and differentiation: Ihh/Pthlh, BMP and FGF signaling in chondrogenesis

Abstract

Bones of vertebrate limbs are formed by endochondral ossification. During this process a cartilage model of the future skeletal elements initially forms. Chondrocytes in the cartilage model undergo various steps of differentiation from proliferating into hypertrophic chondrocytes, which are subsequently replaced by bone. One of the critical steps during this process is the regulation of chondrocyte proliferation and differentiation in the developing cartilage anlagen. Previous studies have demonstrated that Indian hedgehog (Ihh) and Parathyroid hormone-like peptide (Pthlh) interact in a negative feedback loop to regulate chondrocyte differentiation. Ihh, which is expressed in prehypertrophic chondrocytes, activates the expression of Pthlh in the periarticular region of the developing skeletal elements. Pthlh in turn signals back to its receptor (Pthr) in proliferating and hypertrophic chondrocytes, and prevents the onset of hypertrophic differentiation of chondrocytes, thereby inhibiting Ihh expression. In addition, Ihh was shown to positively regulate chondrocyte proliferation. Several lines of evidence suggest an interaction of the Ihh/Pthlh pathway with other signaling factors, including Bone morphogenetic proteins (BMPs) and Fibroblast growth factors (FGFs). Previous studies on chicken limbs have shown that ectopically expressed activated BMP receptor 1A upregulates the expression of Pthlh and blocks chondrocyte differentiation. Therefore, it was hypothesized that BMPs act downstream of Ihh and mediate the Ihh signals to induce Pthlh expression. In this study, a potential interaction of the Ihh/Pthlh and BMP signaling pathways was analyzed using a culture system for embryonic mouse and chick limbs, which was supplemented with activators and inhibitors of both signaling pathways. The results have shown that BMPs are not acting as secondary signals of Ihh in mediating the induction of Pthlh expression. Instead BMP signaling acts at various steps of chondrocyte differentiation and interacts with Ihh signaling in different ways. First, both BMP and Ihh signals are essential for chondrocyte proliferation and act in parallel. Second, BMP signaling regulates the expression level of Ihh thereby coordinating the rate of chondrocyte proliferation and the onset of hypertrophic differentiation. Third, a negative role for BMP signaling was identified in regulating the differentiation of terminal hypertrophic cells. A third signaling pathway critical for proliferation and differentiation of chondrocytes is the FGF signaling pathway. Constitutive activation of the FGF receptor 3 (Fgfr3) gene results in specific dwarfism syndromes in human and mice. On the molecular level activated FGF signaling results in reduced proliferation and differentiation of chondrocytes. In this study the epistatic relationship of FGF signaling with the Ihh/Pthlh and BMP signaling pathways was analyzed. Activation of FGF signaling in the limb culture system showed decreased chondrocyte proliferation and reduced Ihh expression similar to that in a mouse model for human dwarfism (FGFach mouse). Moreover FGF signaling acts upstream of Ihh/Pthlh signaling and regulates the onset of hypertrophic differentiation indirectly by regulating Ihh expression. Furthermore, FGF signaling advances the hypertrophic differentiation process instead of inhibiting it, as it was proposed in previous studies. Additionally, as activation of FGF signaling resembles a loss of BMP signals the interaction of FGF and BMP signaling was analyzed. Both pathways were found to have antagonistic functions during chondrocyte development. Moreover, activation of BMP signaling in FGFach mice in the limb culture system can increase the reduced rate of chondrocyte proliferation and Ihh expression thus rescuing the dwarfism phenotype. Summarizing, the results of this study allowed to integrate three signaling pathways, Ihh/Pthlh, BMP and FGF, into a common control network regulating chondrocyte development.

Die Mehrzahl der Vertebratenknochen wird durch endochondrale Ossifikation gebildet. Während dieses Prozesses werden zunächst knorpelige Skelettelemente ausgebildet. Die Chondrozyten in der Knorpelanlage differenzieren in mehreren Schritten von proliferierenden zu hypertrophen Chondrozyten, die dann durch Knochengewebe ersetzt werden. Ein entscheidender Schritt in diesem Prozess ist die Regulation der Proliferation und der hypertrophen Differenzierung der Chondrozyten. Frühere Studien haben gezeigt, dass "Indian hedgehog" (Ihh) und "Parathyroid Hormone like Peptide" (Pthlh) die Chondrozytendifferenzierung in einem negativen "feed back loop" regulieren. Ihh, welches in prehypertrophen Chondrozyten exprimiert wird, aktiviert die Expression von Pthlh in der periartikulären Region sich entwickelnder Skelettelemente. Pthlh seinerseits aktiviert seinen Rezeptor (Pthr) in den proliferierenden und frühen hypertrophen Chondrozyten, wodurch das Einsetzen der Chondrozytendifferenzierung und damit die Expression von Ihh inhibiert wird. Ausserdem erwies sich Ihh als positiver Regulator der Chondrozytenproliferation. Neben dem Ihh/Pthlh Signalsystem spielen eine Anzahl weiterer Faktoren, beispielsweise "Bone Morphogenetic Proteins" (BMPs) und die "Fibroblast Growth Factors" (FGFs), eine bedeutende Rolle in der Chondrozytenentwicklung. Frühere Studien an Hühnergliedmassen haben gezeigt, dass ektopische Expression eines aktivierten BMP Rezeptors 1A die Expression von Pthlh hochreguliert und die Differenzierung der Chondrozyten blockiert. Dies hat zu der Hypothese geführt, dass BMPs "downstream" von Ihh agieren und die Aktivierung der Pthlh Expression vermitteln. Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktion des Ihh/Pthlh Signalsystems mit BMP-Signalen näher zu untersuchen. Dabei wurde eine in vitro Kultivierungsmethode für Gliedmassen von Maus- und Hühnerembryonen etabliert, die die Untersuchung verschiedener Wachstumsfaktoren ermöglicht. Es konnte gezeigt werden, dass BMP-Signale nicht als Mediatoren des Ihh-Signals zur Regulation der Pthlh Expression dienen. Der BMP-Signalweg spielt jedoch bei verschiedenen anderen Schritten der Chondrozytendifferenzierung eine Rolle und interagiert mit dem Ihh-Signalweg auf unterschiedliche Weise. Zum einen regulieren sowohl BMP- wie auch Ihh- Signale die Chondrozytenproliferation, wobei beide Signale parallel agieren. Zweitens regulieren BMPs die Expression von Ihh und koordinieren damit die Chondrozytenproliferation und das Einsetzen der hypertrophen Differenzierung. Drittens verzögert der BMP-Signalweg die Differenzierung der terminalen hypertrophen Chondrozyten. FGFs bilden eine dritte Gruppe von Wachstumsfaktoren, die die Proliferation und die Differenzierung der Chondrozyten regulieren. Konstitutive Aktivierung des FGF Rezeptor 3 Gens (Fgfr3) führt zu den Zwergwuchssyndromen bei Mensch und Maus. Auf molekularer Ebene wurde gezeigt, dass Aktivierung des FGF-Signalwegs die Regionen der proliferierenden und differenzierenden Chondrozyten verkleinert. In dieser Arbeit wurden die epistatischen Beziehungen der FGF-Signale mit den Ihh/Pthlh- und BMP-Signalwegen untersucht. Die Aktivierung des FGF-Signalwegs in der Gliedmassenkultur hat eine herabgesetzte Chondrozytenproliferation und eine reduzierte Ihh Expression zur Folge, vergleichbar mit dem Phänotyp der Mausmodelle mit aktiviertem FGF-Signalweg (FGFach Maus). Ausserdem wirken FGF- Signale "upstream" des Ihh/Pthlh-System und steuern das Einsetzen der hypertrophen Differenzierung indirekt durch Regulierung der Ihh Expression. Im übrigen beschleunigen FGF-Signale den hypertrophen Differenzierungsprozess, anstatt ihn zu verzögern, wie in früheren Studien angenommen wurde. Da in Gliedmassenkulturen eine Aktivierung des FGF-Signalwegs einer Inhibierung von BMP Signalen gleicht, wurde die Interaktion von FGF und BMP Signalen untersucht. Beide Signalwege haben eine antagonistische Funktion während der Chondrozytenentwicklung. Ferner führt die Aktivierung von BMP-Signalen in FGFach Mäusen zu einer Anhebung der reduzierten Proliferationsrate und Ihh Expression und wirkt somit dem Zwergwuchsphänotyp entgegen. Aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit wurde ein Modell aufgestellt, welches drei Signalwege (Ihh/Pthlh, BMP und FGF), die die Proliferation und die Differenzierung der Chondrozyten regulieren, in ein gemeinsames Kontrollnetzwerk integriert.