dc.contributor.author
Natek, Maja
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:46:28Z
dc.date.available
2017-07-28T10:58:42.789Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/12426
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-16624
dc.description.abstract
Keratinocytes are essential structural components of the epidermis that also
have a surveillance role in epidermal immunity. As nonprofessional immune
cells they have the ability to quickly and efficiently respond to pathogens
and are part of the first-line innate immune defense. Their reaction upon
exposure to pathogens or any other damage of the epidermal barrier results in
a strong inflammatory response which activates signaling cascades to restore
the intact barrier and protect the host from severe damage. Pathogen-
associated molecular patterns (PAMPs) are specific parts of microbes that
serve as a critical alert for keratinocytes by binding to pathogen recognition
receptors (PRRs). These receptors are specifically expressed throughout cell
types which enables efficient screening and defense against harmful
infections. Toll-like receptors (TLRs) are the most characterised group of
PPRs found on the cell surface (TLR1,2,4,5-6) and intracellular compartments
(TLR3 and 9) in keratinocytes. PAMP binding to TLRs causes a change in
receptor confirmation and activation of downstream signaling cascades by
triggering nuclear factor kappa B (NF-κB) or interferon regulatory factor
(IRF), which both result in an abundant release of pro-inflammatory molecules.
TLR function in keratinocytes has previously been investigated, but their
contribution to epidermal homeostasis is not yet fully understood.
Accordingly, the present thesis aimed to elucidate involvement of TLRs in the
regulation of epidermal homeostasis by the use of specific TLR agonists and
analyzis of cell growth, differentiation and inflammation. Functionality of
TLR2, 3 and 9 in keratinocytes was confirmed by enhanced release of pro-
inflammatory molecules CXCL-8, IL-1α and TNF upon selective exposure of
keratinocytes to TLR agonists. It could further be confirmed that TLR9 is
responsible for innate immune responses to bacterial DNA in keratinocytes.
Furthermore, the impact of longer, 24-mer, oligonucleotides CpG- and its
control GpC-ODN with a phosphorotio-backbone (PS-ODN) was investigated in
normal human keratinocytes (NHK) and epithelial cell lines HaCaT, SCC-12 and
SCC-25. The stimulation of epidermal cells with TLR9 ligands resulted in
remarkable production and upregulation of pro-inflammatory cytokines (CXCL-8,
IL-1α and TNF-α). In addition, when keratinocytes were pre-treated with an
inhibitor of endosomal acidification chloroquine, CXCL8 production was
abrogated. The same effect was revealed after TLR9 knockdown, confirming
TLR9-dependent cytokine induction. Here, it is also shown that TLR stimulation
did not significantly impair normal keratinocytes but led to the modulation of
cellular growth processes in hyperproliferative and malignant keratinocytes.
Interestingly, CpG- and GpC-ODN had only minor growth inhibitory effects
against normal keratinocytes and SCC-12, but almost completely inhibited cell
growth in HaCaT and SCC-25 cell lines, and this effect could not be abrogated
by chloroquine, which points to TLR9-independent effects. CpG-ODN stimulated
keratinocytes also responded with upregulation of hBD-1 and 3, whereas no
expression and upregulation could be observed in malignant cell lines. Taken
together, skin epithelial cells recognize and respond to PS-ODNs and can
actively contribute to innate immune responses and inhibition of
hyperproliferative activity. Whilst anti-proliferative effects of PS-ODNs were
TLR9-independent, it could be confirmed that TLR9 regulates differentiation
processes of keratinocytes. Hence, TLR9 silencing leads to remarkable
upregulation of differentiation markers. The results here indicate that
interaction of keratinocytes with pathogens occurs on multiple levels, which
could be linked to resistance mechanisms of epidermis against infections. It
has been well documented that sphingosine-1-phosphate (S1P) is an important
bioactive molecule that exerts its effects by binding to its receptor
subtypes. Here, it is shown that S1P induces pro-inflammatory responses in
keratinocytes by releasing CXCL8 and IL-6 independently of the receptor
subtypes S1PR1-3 since specific S1PR antagonists could not abrogate cytokine
release. Moreover, S1P reduced proliferation of normal keratinocytes, wherease
increased the proliferation of hyperproliferative cell line HaCaT. In
addition, a potential crosstalk of S1P and TLR signalling in epidermal
inflammation was evaluated. Addition of S1P clearly intensified pro-
inflammatory TRL signalling in keratinocytes, in particular intracellular TLR3
and 9 activation. Moreover, enhanced production of pro-inflammatory molecules
was S1PR1-3-independent. Of interest, presented results show evidence for
synergistic interaction between TLR and S1P in keratinocytes, which was
observed in high IL-6 and also decreased total STAT3 release. As deregulated
STAT3 activity is common in malignant processes, is this observation of
interest for TLR9 agonist CpG-ODN, which impaired the growth of squamous
carcinoma cell lines. Currently, limited amount of data is available about TLR
modulation of S1P levels. The expression of SPP1 and S1PL was induced by TLR3
agonist Poly(A:U) and TLR9 Agonist ODN2006. This induction of S1P degrading
enzymes was in correlation with slight intracellular decrease of S1P and
increase of Sph. Furthermore, after inhibition of anabolic SphK altered CXCL8
levels were observed only with TLR2 agonist HKLM, whereas no difference in
release could be seen in case of Poly(A:U) and CpG-ODN. On the contrary, the
inhibition of S1PL enhanced TLR3 and TLR9-mediated pro-inflammatory response,
which was also demonstrated by S1PL-knockdown results. This supports the
proposed action of S1P as the enhancer of epidermal immunity and its
preferable collaboration with intracellular TLRs. In the first part of this
work an involvement of TLR9 in differentiation of keratinocytes was revealed.
In this agreement, the crosstalk of S1PL and TLR9 signalling was further
investigated in this regard. The inhibition and knockdown of S1PL before TLR9
led to enhanced CXCL8 release and simultaneously increased expression of
epidermal differentiation markers KRT10, IVL and FLG, both typical for the
most outer epidermal layer stratum corneum. This presents a previously unknown
role of S1PL in mediation of TLR9 signalling upon bacterial encounter, where
S1PL most probably contributes to surveillance of epidermal TLR9 signalling.
Taken together, this work confirmed the cooperation of TLR and S1P in
regulation of epidermal inflammatory and differentiation processes. The
strategic position of TLR, S1P and S1P metabolizing enzymes enables their
collaboration in order to assure a proper response by keratinocytes against
pathogens.
de
dc.description.abstract
Die Keratinozyten sind essenzielle Bestandteile der Epidermis, die auch eine
Überwachungsrolle in der epidermalen Immunfunktion spielen. Auch als
untypische Immunzellen sind sie in der Lage, schnell und effizient auf die
Pathogene zu antworten und bilden damit einen Teil der ersten Reihe der
angeborenen epidermalen Immunabwehr. Nach Enttarnung durch die Pathogene oder
einen anderen Schaden der epidermalen Barriere reagieren die Keratinozyten mit
einer verstärkten Entzündungsreaktion, die darüber hinaus eine Signalkaskade
aktiviert, um die Barriere schnellstmöglich zu reparieren und den Wirt vor
größeren Schäden zu schützen. Pathogen-assoziierte molekulare Strukturen
(PAMPs) sind spezifische Teile der Mikroben, die nach der Bindung an die
Pathogenstruktur-Erkennungsrezeptoren (PRRs) eine kritische Warnung für die
Keratinozyten darstellen. Diese Rezeptoren sind gezielt in den verschiedenen
Zelltypen exprimiert, was einer effizienten Früherkennung und Abwehr von
gefährlichen Infektionen dient. Die Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind die meist
erforschte Gruppe der PRRs und sind in den Keratinozyten an der Zelloberfläche
(TLR1,2,4,5,6) und in den intrazellulären Kompartimenten (TLR 3,9) zu finden.
Die PAMP-Bindung an die TLRs verursacht eine Änderung der Rezeptorkonfirmation
und aktiviert dadurch die zellulären Signalkaskaden, wodurch eine reichliche
Freisetzung der pro-inflammatorischen Moleküle wie CXCL8 und IL-6 gefördert
wird. Die TLR Funktionalität in den Keratinozyten wurde bereits bestätigt,
jedoch ist ihre Bedeutung in der epidermalen Homöostase noch nicht vollständig
bekannt. Demzufolge wurde in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe der
spezifischen TLR Agonisten die Beteiligung der TLR an der
Entzündungsregulierung, dem Zellwachstum und der Zelldifferenzierung in
normalen und modifizierten Keratinozyten untersucht. Die Aktivierung von TLR
2,3 und 9 erhöht die Freisetzung der CXL8, IL-1α und TNF. Des Weiteren konnte
die TLR9-abhängige pro-inflammatorische Wirkung bestätigt werden. Zudem wurde
der Effekt der längeren (24mer) Oligonukleotiden CpG und deren Kontrolle GpC,
die eine Phosphothio-Bindung enthalten (PS-ODN), in den normalen humanen
Keratinozyten und epithelischen Zelllinien HaCaT, SCC-12 und SCC-25
untersucht. Alle Zelltypen reagierten mit einer erhöhten Expression und
Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine (CXCL8, IL-1α und TNF).
Interessanterweise hat die Blockade des TLR9 durch Chloroquine und siRNA
Knockdown des TLR9 die CXCL8 Freisetzung reduziert. Dies deutet darauf hin,
dass die pro-inflammatorische Wirkung der CpG-und GpC-ODN TLR9-abhängig ist.
Es wurde auch gezeigt, dass CpG- und GpC-ODN keinen Einfluss auf die
Zellviabilität der normalen Keratinozyten haben, wohingegen sie aber die
Viabilität und das Wachstum der modifizierten und malignen Keratinozyten
beeinflussten. Somit wurde dieser anti-proliferative Effekt am stärksten bei
den HaCaT und SCC-25 Zellen beobachtet, welche nicht mittels Chloroquine
Blockade unterbrochen wurden, was auf eine TLR9-unabhängige Wirkung hindeutet.
Dahingegen wurden die Differenzierungsmarker nach der Stimulation mit CpG- und
GpC-ODN erhöht, die nach siRNA Knockdown des TLR9 noch stärker induziert
wurden, was eine aktive TLR9-Beteiligung an den epidermalen
Differenzierungsprozessen aufzeigt. Zusammengefasst geben diese Ergebnisse
erste Hinweise auf ein multi-level Zusammenspiel zwischen Keratinozyten und
Pathogenen, das in Verbindung mit einem Resistenzmechanismus der Epidermis
gegen Infektionen stehen könnte und dienen als Anhaltspunkt für weitere
Studien in dieser Richtung. Sphingosine 1-phosphate (S1P) ist ein wichtiges
bioaktives Molekül, das seine Wirkung maßgeblich über seine Rezeptoren (S1PR)
vermittelt. Die hier erstmals gezeigte pro-inflammatorische Wirkung des S1P in
Keratinozyten konnte nicht mittels S1PR1-3 Antagonisten reduziert werden.
Darüber hinaus wurde hier ein abweichender S1P Einfluss auf die
Zellproliferation untersucht. So konnte eine bereits bekannte
antiproliferative Wirkung des S1P in Keratinozyten bestätigt werden,
wohingegen bei den modifizierten Hautzellen eine Tendenz zu beschleunigter
Proliferation zu beobachten war. Die Kombination der TLR 2,3 und 9 Agonisten
mit S1P verstärkt die pro-inflammatorische Signalisierung der TLR,
insbesondere des TLR3 und TLR9. Eine S1PR1-3 Beteiligung konnte nicht
bestätigt werden. Zudem deuten die Ergebnisse auf eine synergetische Wirkung
zwischen TLR, S1P und wahrscheinlich STAT3 Signalisierung hin, da ein Anstieg
der IL-6 Menge parallel zur reduzierten gesamten STAT3 Freisetzung aufgezeigt
werden konnte. Die SPP1 und S1PL Expression wurde durch TLR3 Agonisten
Poly(A:U) und TLR9 Agonisten CpG-ODN induziert. Diese Erhöhung der S1P-
Abbauenzyme stand in Zusammenhang mit der leichten Senkung der intrazellulären
S1P und einem Anstieg der SpH Menge. Des Weiteren wurde die CXCL8 Sekretion
nach der SphK Inhibition nur in TLR2-stimulierten normalen Keratinozyten
verändert, wohingegen die in TLR3 und TLR9-stimulierten Keratinozyten
unverändert blieben. Hingegen wurde die CXCL8 Freisetzung nach der S1PL
Inhibition mittels 4-DPH in TLR3 und TLR9-stimulierten Keratinozyten deutlich
erhöht. Dies weist auf ein bevorzugtes Zusammenspiel des S1P mit den
intrazellulären TLR hin. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die S1PL
Beteiligung in der TLR9-vermittelten Differenzierung der Keratinozyten
untersucht. Die S1PL-Inhibition und siRNA Knockdown der TLR9-stimulierten
Keratinozyten führten zu einer verstärkten Expression der
Differenzierungsmarker IVL und FLG unter gleichzeitig erhöhter CXCL8
Freisetzung. Die erzielten Ergebnisse legen eine bis dato unbekannte Funktion
des S1PL in den TLR9 Signalwegen dar und geben einen Hinweis auf eine
Überwachungsrolle in der epidermalen Immunabwehr. Zusammengefasst bestätigte
diese Arbeit die Zusammenarbeit der TLR und S1P in der Regulierung der
inflammatorischen Signalwege und Differenzierungsprozesse in Keratinozyten.
Die vermeintlich strategische Position der TLR, S1P und S1P-metabolisierenden
Enzyme ermöglicht eine effektive Immunantwort auf die Pathogene.
de
dc.format.extent
ix, 137 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Toll-like receptor
dc.subject
sphingosine 1-phosphate
dc.subject
pro-inflammatory response
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Molecular mechanisms of epidermal immune defense
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Günther Weindl
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. med. Margitta Worm
dc.date.accepted
2017-07-07
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000105112-5
dc.title.subtitle
Crosstalk of Toll-like receptors and Sphingosine 1-phosphate in keratinocytes
dc.title.translated
Molekulare Mechanismen der epidermalen Immunabwehr
en
dc.title.translatedsubtitle
Kooperation zwischen Toll-like Rezeptoren und Sphingosin 1-phosphat in
Keratinozyten
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000105112
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000021872
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access