Oligomerisierung des arginin-reichen Motivs des HIV-1 TAT Protein als neue Peptidvektoren für den Gentransfer: Untersuchungen zu der Gentransfereffizienz in vitro und in vivo

Abstract

In dem ersten Teil der Dissertation sollte ein neuer Ansatz für das Design eines innovativen Gentransfervektor entworfen werden, mit dem Ziel effizienter als die bisher verfügbaren nicht-viralen Vektoren Gentransfer zu vermitteln. Die genaue Analyse des Mechanismus, der dem nicht-viralen Gentransfer zugrunde liegt, offenbarte die Schwachpunkte von den bis dato verwendeten nicht-viralen Gentransfervektoren. In diesem Zusammenhang stellten die Freisetzung aus den Endosomen, sowie der Transport des Transgens in den Zellkern stationärer Zellen die größten Barrieren dar. Das Design des neuen Gentransfervektors zielte folglich auf die Überwindung dieser beiden Barrieren ab. Mit Hilfe des arginin-reichen Motiv des HIV 1-TAT Protein, kurz TAT-Sequenz, das einerseits eine Proteintransduktionsdomäne und andererseits eine Kernlokalisierungssequenz in einem Peptid darstellt, sollten eben genau diese Barrieren überwunden werden können. Ein solches System hätte den Vorteil, dass mit einem Vektor zwei der am stärksten limitierenden Barrieren im Prozess des Gentransfers in einem Schritt überwunden werden könnten. Zu diesem Zweck sollte die TAT-Sequenz oligomerisiert werden und jedes der Oligomere als eigenständiger Vektor für den Gentransfer untersucht werden. Speziell sollte untersucht werden, ob der Grad der Oligomerisierung einen Einfluss auf die biophysikalischen Parameter der resultierenden Genvektoren hatte und ob diese Parameter im Zusammenhang mit dem Oligomerisierungsgrad mit der Gentransfereffizienz korrelierten. In einem zweiten Teil dieser Dissertation sollte die Gentransfereffizienz von kationischen Polymeren, wie z.B. Polyethylenimin (PEI) 25 kDa und Polyamidoamin-Dendrimeren in vivo in die Mauslunge untersucht werden als denkbarer Ansatz, die Zystische Fibrose gentherapeutisch zu behandeln. In vorangegangen Untersuchungen erwiesen sich gerade PEI 25 kDa und Polyamidoamin-Dendrimere als effiziente Vektoren speziell Bronchialepithel auch unter Einfluss von in der Lunge natürlich vorkommende Surfactant in vitro zu transfizieren. Zu dem damaligen Zeitpunkt waren keine Daten zu der in vivo Gentransfereffizienz in die Lunge der beiden kationischen Polymere bekannt. Es sollte daher als erstes eine Methode zur intratrachealen Applikation von Gentransfervektoren entwickelt werden. In diesem Zusammenhang sollten nicht nur die Bedingungen für den Gentransfer der beiden kationischen Polymere optimiert werden, vielmehr sollte auch der Einfluss von Lungensurfactant auf die in vivo Gentransfereffizienz, sowie der zeitliche Verlauf der Transgenexpression und die Verträglichkeit mit möglicher inflammatorischen Antwort der Mauslunge untersucht werden. Des Weiteren sollte die Gentransfereffizienz der kationischen Polymere mit der von kationischen Lipiden, die zu dem damaligen Zeitpunkt bereits gut untersucht waren, verglichen werden. Welche der beiden Klassen von kationischen Genvektoren ist effizienter? Da vorangegangene Arbeiten anderer Gruppen liganden-modifizierte Vektoren für den gezielten rezeptorvermittelten Gentransfer sehr erfolgreich eingesetzt haben, sollte diese Möglichkeit zusätzlich für den Gentransfer in die Lunge untersucht werden. Des Weiteren sollten die in dem ersten Abschnitt entwickelten neuen Genvektoren basierend auf der TAT-Sequenz auf ihr Potenzial Gentransfer in vivo in die Lunge zu vermitteln untersucht werden. Schließlich erscheint die Vernebelung von Genvektoren als die geeignetste Applikationsmethode in die Lunge in Hinblick auf zukünftige eventuelle humane Anwendungen. Von einer anderen Arbeitsgruppe wurden bereits erste sehr erfolgreiche Ergebnisse mit vernebelten PEI Polyplexen berichtet (Densmore et al., Mol Ther, 1, 180-8. 2000). Es ist jedoch aus der Literatur bekannt, dass die Gentransfereffizienz von PEI Polyplexen stark von dem Solvens, das zu ihrer Formulierung verwendet wird abhängig ist. In diesem Kontext sollte der Einfuß unterschiedlicher Solventien auf partikuläre Parameter vor und nach Vernebelung von PEI Polyplexen untersucht werden und diese wenn möglich mit der biologischen Aktivität, d.h. der Transfektionseffizienz korreliert werden.

In the first section of the thesis a novel gene transfer vector was designed to improve gene transfer efficiency as compared with standard nonviral gene vectors. Nonviral gene transfer still remains inefficient due to basic mechanistic barriers such as inefficient endosomal escape and, in particular, poor nuclear uptake of the DNA complexes. A novel promising strategy was developed to overcome these barriers by designing a peptide vector based on the arginine-rich motif of the HIV-1 TAT protein (TAT-peptide). The TAT- peptide has been shown to function as a protein transduction domain (PTD), i.e. to mediate translocation of heterologous proteins into cells by crossing cell membranes in a manner different from endocytosis. In addition, the TAT- peptide has been shown to function as nuclear localization sequence (NLS) which directly interacts with a nucleocytoplasmic shuttle protein to mediate nuclear import. As a consequence, these properties of the TAT-peptide should substantially improve gene delivery. In order to take the impact of polyelectrolyte binding and stability on gene transfer into consideration for vector design, the dimer, trimer and tetramer of the TAT-peptide was synthesized as novel peptide vectors and their properties for the use in gene transfer was investigated. It was attempted to find a correlation between the degree of oligomerisation of the TAT-peptide, the resulting biophysical parameters and the gene delivery efficiency in context with the unique cell physiologic functions of the TAT-peptide. In the second section of the thesis the gene transfer efficiency mediated by cationic polymers such as polyethylenimine (PEI) 25 kDa and fractured polyamidoamine dendrimers to the mouse lung in vivo was investigated. Previous studies have shown that the gene transfer efficiency mediated by PEI and fractured polyamidoamine dendrimers on bronchial epithelial cells was high even in the presence of lung surfactant. However, at this time no data were available for their potential to mediate gene transfer in vivo to the mouse lung. To investigate their gene transfer efficiency in vivo an intratracheal application method was developed. Gene transfer efficiency of both cationic polymers was optimised and the effect of lung surfactant on gene transfer efficiency was examined. In addition, the time course of transgene expression and the inflammatory response induced by the gene vectors was investigated. Gene transfer efficiency mediated by the cationic polymers was compared with the efficiency mediated by cationic lipids. In previous studies ligand modified gene vectors have been successfully used for receptor-mediated gene transfer. For this reason, this opportunity has been investigated for gene delivery to the lung. In addition, in this section the potential of the TAT-peptides to enhance gene transfer in the lung in vivo was examined. Aerosol drug delivery currently represents the most acceptable and convenient delivery system for repeated drug application to the lungs. The group of Densmore has shown that PEI polyplexes can mediate gene transfer after nebulisation in vivo. However, gene transfer efficiency of PEI polyplexes has been shown to be influenced by the solvent used for complex formulation. In this context, the effect of jet nebulisation on such particle parameters of PEI/DNA polyplexes when formulated with commonly used solvents was investigated. The effect of jet nebulisation on particle parameters was compared to transfection efficiency in order to correlate physical parameters of the polyplexes with biological activity.