Entwicklung molekularer Adapter zur Optimierung von Immunotoxinen

Abstract

Aufgrund der schwerwiegenden Nebenwirkungen von herkömmlichen Zytostatika gewinnen immuntherapeutische Verfahren bei der Behandlung von Krebserkrankungen zunehmend an Bedeutung. Die Verwendung von Immunotoxinen stellt dabei ein vielversprechendes Konzept dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten molekulare Adapter entwickelt werden, die die toxineigene Translokationsdomäne in Immunotoxinen ersetzen und zu einer effektiven sowie irreversiblen Aufnahme der toxischen Domäne ins Cytosol der Zielzellen führen. Ein vollständiger Adapter besteht dabei aus einem toxinunabhängigen Membrantransferpeptid (Trojanisches Peptid), das toxinseitig von einer cytosolisch und ligandseitig von einer endosomal spaltbaren Bindung flankiert wird. Ziel war es, daß nach Bindung des Liganden an einen tumorspezifischen Rezeptor und endocytotischer Internalisierung des Komplexes die endosomal spaltbare Bindung gespalten wird. Dadurch sollte das Trojanische Peptid aktiviert werden und den Transfer der cytotoxischen Domäne ins Cytosol vermitteln. Nach Spaltung der cytosolisch spaltbaren Bindung sollte die cytotoxische Komponente akkumulieren, da sie ohne Transfersequenz nicht mehr membrangängig ist, und durch eine Inhibition der Proteinbiosynthese schließlich den Zelltod vermitteln. Als cytotoxisches Agens wurde die enzymatisch aktive A-Kette von Diphtheriatoxin verwendet. Die toxinvermittelte ADP-Ribosylierung von Elongationsfaktor II, durch die in vivo die Proteinbiosynthese inhibiert wird, konnte ausnahmslos für jedes Konstrukt nachgewiesen werden. Dabei wurde auch deutlich, daß C-terminale Fusionsanteile die enzymatische Aktivität nicht beeinflussen. Als tumorspezifischer Ligand wurde ein transferrinunabhängiges Peptid verwendet, für das in dieser Arbeit erstmalig eine konzentrationsabhängige Transferrinrezeptorbindung in einem zellfreien System nachgewiesen werden konnte. Die verschiedenen Immunoadaptertoxine wurden effizient und mit einheitlicher Zusammensetzung rekombinant dargestellt. Die cytosolisch spaltbare Sequenz wurde dabei durch Erkennungsmotive für Caspasen, die endosomal spaltbare Sequenz durch solche für Proproteinconvertasen repräsentiert. Als Membrantransfersequenz fanden drei verschiedene Trojanische Peptide Verwendung. Für die endosomal spaltbare Sequenz konnte die beabsichtigte Spaltung durch Proproteinconvertasen aus Membranfraktionen einer Hepatokarzinomzellinie nachgewiesen werden, wobei die cytosolisch spaltbare Sequenz unverändert blieb. Außerdem konnte gezeigt werden, daß ein C-terminal fusionierter Ligand keinen Einfluß auf die Spaltung hat. Da die hergestellten Immunoadaptertoxine in Cytotoxizitätsassays nicht über die von ihnen erwartete cytotoxische Aktivität verfügten, ist in Zukunft die Untersuchung des cytotoxischen Potentials weiterer Konstrukte mit anderen tumorspezifischen Liganden und den verwendeten Transfersequenzen von großem Interesse. Erste, vielversprechende Hinweise diesbezüglich erbrachte inzwischen ein auf den Daten dieser Arbeit basierendes Immunoadaptertoxin mit epidermalem Wachstumsfaktor als tumorspezifischer Ligand. Es zeigte neben einer ausgeprägten Zielzellspezifität auch eine hohe Cytotoxizität.

During the last few years there has been an increased interest in the development of immune therapies for the treatment of cancer due to the numerous severe side effects resulting from conventional cytotoxic drugs. In the field of immune based therapies a very promising approach is the use of immunotoxins. The objective of this work was to develop a universal molecular adapter for immunotoxins that can translocate the toxic moiety and results in its irreversible cellular uptake in the cytosol. The adapter consists of a membrane transfer unit (trojan peptide) flanked by a cytosolic and an endosomal cleavable unit. The cytosolic cleavable unit and endosomal cleavable unit contain consensus motives for the caspases and proprotein convertases respectively. Three different trojan peptides were tested for their translocating ability. The role of the adapter is based on the following uptake mechanism: after receptor-based binding of the tumor-specific ligand the receptor complex is internalized via endocytosis. Cleavage of the endosomal cleavable unit exposes the trojan peptide that translocates the toxic domain into the cytosol. Cleavage of the cytosolic cleavable unit results in the accumulation of the toxic domain, which mediates cell death by the inhibition of protein synthesis. The different immunoadaptertoxins developed in this study could be efficiently produced by recombinant techniques and purified to homogeneity. The enzymatic active A-chain of diphtheria toxin served as cytotoxic component. Protein synthesis is inhibited by ADP-ribosylation of elongation factor II. All constructs exhibited a similar in vitro enzymatic activity compared to native diphtheria toxin, thus showing that C-terminal fusions exert no effect on the activity. A transferrin receptor binding peptide acted as tumor-specific ligand. In a cell free assay it could be demonstrated for the first time that this peptide binds to the transferrin receptor in a concentration-dependent manner. The cleavage of the endosomal cleavable unit could be clearly demonstrated using both recombinant proprotein convertase and the membrane fraction from a hepatocarcinoma cell line. The cytosolic cleavable unit remained unaffected. Additionally it could be shown that a C-terminal fused ligand has no effect on the reaction. The immunoadaptertoxins developed in this study did not exhibit the expected cytotoxic activity in a cell-based assay. Therefore further studies are required using other tumor-specific ligands. Based on the results of this work, promising results were recently obtained with immunoadaptertoxins using epidermal growth factor as tumor-specific ligand. The constructs possess an excellent cell binding specificity as well as a high cytotoxic activity.