Analyse von Neisseria meningitidis mit Protein Microarrays

Abstract

Neisseria meningitidis ist der Hauptverursacher der bakteriellen Meningitis. Über 500.000 Fälle treten jährlich auf, hauptsächlich während Epidemien in Afrika. Neisseria meningitidis ist ein ausschließlich humanpathogenes Bakterium. Um im Wirt überleben zu können, hat dieses Bakterium verschiedene Mechanismen entwickelt, wie z.B. den der Phasenvariation, worunter die Änderung in der Anzahl repetitiver Elemente im Genom verstanden wird. In Neisseria meningitidis MC58 sind 102 phasenvariable Gene bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, einen Neisseria meningitidis Proteinarray zu entwickeln und diesen mit humanen Seren zu untersuchen. Dabei sollten in zwei unabhängigen Versuchsreihen Prä- und Postimmunseren von geimpften Patienten, sowie Seren von Patienten mit einer Meningitis-Infektion und den entsprechenden alters- und geschlechtsgleichen Kontrollpersonen charakterisiert werden. Dafür wurden zuerst alle 102 bekannten phasenvariablen Gene des Bakteriums aus seiner genomischen DNA amplifiziert und in einen Proteinexpressionsvektor kloniert. Die Proteine wurden exprimiert, und es gelang, für 87 Konstrukte die entsprechenden Proteine aufzureinigen, die im Anschluß zur Erstellung von Microarrays verwendet wurden. In Vorversuchen wurden verschiedene Oberflächen und Screeningbedingungen für die Microarrays getestet. Als am besten geeignete Oberfläche erwies sich Nitrocellulose. Auf diese so beschichteten Glasarrays wurden die Proteine gespottet, mit Serum gescreent und unter Berücksichtigung von Kontrollen bewertet. Bei der ersten Versuchsreihe waren Personen mit einer äußeren Membranvesikel Präparation von Neisseria meinigitidis geimpft worden. Das äußere Membranprotein Omp85 wurde auf den Arrays mit 9 von 10 Seren dieser Personen detektiert. Eine spezifische Antikörpererkennung im Serum konnte für dieses Protein durch einen Kompetitionsversuch bestätigt werden. Die Funktion von Omp85 ist noch nicht völlig geklärt, eine Beteiligung an der Biogenese der äußeren Membran wird vermutet. Neben diesem wurde ein weiteres Protein der äußeren Membran detektiert, PorA, welches bereits in Testimpfstoffen verwendet wird. In einer zweiten Versuchsreihe konnten Antikörper gegen das Opa-Protein (NMB0442) in 11 der 20 Meningitis Patientenseren detektiert werden. Opa- Proteine besitzen hochvariable Sequenzen und werden als wichtige Virulenzfaktoren eingestuft. Interessanterweise konnte Omp85 sowie PorA mit den Seren der Meningitis Patienten nur in wenigen Patienten detektiert werden. Weiterhin konnte durch verkürzte Konstrukte für PorA und Omp85 gezeigt werden, daß Bindungsstellen über die gesamte Länge des Proteins vorhanden waren. Damit gelang es, in dieser Arbeit den ersten Neisseria meningitidis Proteinarray zu entwickeln, der gleichzeitig den ersten bakteriellen Protein Microarray darstellt. Die starke Immunogenität von drei Proteinen konnte gezeigt werden. Besonders hervorzuheben ist das Opa-Protein NMB0442. Dieses Protein war mit einem authentischen Frameshift annotiert, konnte aber rekombinant exprimiert werden und wies beim Screenen mit Patientenseren deutliche Signale auf. Dies zeigt, daß dieses Protein während der Infektion exprimiert wurde.

Neisseria meningitidis is the major causative agent of bacterial meningitis. Over 500.000 cases occur each year, mainly during epidemics in Africa. As an exclusively human commensal and pathogen it has evolved mechanisms like phase variation to survive. Phase variation can be defined as the high frequency, reversible on-off switching of gene expression. In Neisseria meningitidis strain MC58 102 putative phase-variable genes were identified. The aim of this thesis was to develop a Neisseria meningitidis protein microarray and to screen it with human sera. Two different independent series of sera were available: pre- and postimmune sera from vaccine candidates and sera from patients suffering from meningitis. All 102 genes were selected for PCR amplification and cloned into an expression vector. The corresponding proteins were expressed and 87 constructs could be purified. These proteins were used to generate a protein microarray. In preliminary tests different surface structures and screening conditions for the generation of protein microarrays were investigated. The optimal surface that could be characterized was nitrocellulose. Proteins were spotted on these slides under consideration of age- and sex- matched controls. In the first screening experiments the protein microarrays were screened with sera from ten individuals immunized with an outer membrane vesicle vaccine from Neisseria meningitidis. The post- vaccination sera reacted with Omp85, an outer membrane protein. It was detected in nine out of ten sera. A competition experiment was carried out to prove antibody specificity. The function of Omp85 is unknown, an involvement in the biogenesis of the outer membrane is assumed. Beside Omp85 another outer membrane protein PorA was detected which is already used in vaccines. In the second screening study the Opa protein NMB0442 could be identified in 11 of 20 patient sera. Opa proteins are highly phase- and antigenically variable and are important virulence factors. Interestingly, Omp85 and PorA were not identified by sera of the patients suffering from meningitis. In a further experiment different truncated constructs of Omp85 and PorA were investigated and several binding sites could be detected over the whole molecule. Therefore it was possible to generate the first Neisseria meningitidis microarray in this thesis, which is as well the first bacterial protein microarray. The strong immunogenicity of three proteins could be demonstrated. An interesting protein is the Opa-protein NMB0442. This protein was annotated with an authentic frameshift, but it could be expressed as recombinant protein and an immune response was detected with the sera of the patients. That means the protein is expressed during a meningitis infection.