Das induzierbare Ubiquitin-Proteasom System in Neuronen unter pro- inflammatorischen Bedingungen

Abstract

Eine wichtige Funktion des Ubiquitin-Proteasom Systmes (UPS) ist die Generierung von Peptiden, die von dem Molekül MHC I auf der Zelloberfläche den CD8+ T-Lymphozyten präsentiert werden. Zahlreiche Untersuchungen dokumentieren, dass ein gestörtes UPS mit vielen neurodegenerativen Erkrankungen einhergeht. Unter inflammatorischen Prozessen findet durch einen Austausch der katalytisch-aktiven konstitutiven gegen die katalytisch-aktiven induzierbaren Untereinheiten die Bildung des Immunoproteasoms (iP) statt. Das iP bewirkt eine effizientere Peptid-Generierung und eine erhöhte Protein- Abbau-Rate. In neuralen Zellen wurde dieser induzierbare Proteasom-Komplex vor allem bei neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet. Dennoch ist die Funktion des iP in Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS) bislang ungeklärt. Fokus dieser Arbeit war das Immunoproteasom in neuralen Zellen in vitro und in vivo unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen. In der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis erkrankten iP-defiziente Tiere im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen früher und schwerer. Während des inflammatorischen Prozesses im ZNS konnte eine iP-Synthese in Gliazellen, jedoch nicht in Neuronen beobachtet werden. Das Fehlen eines iP-Komplexes führte in den Zellen des ZNS zu einer Akkumulation von Poly-Ubiquitin- Konjugaten, und in der Folge zur Apoptose und einem verstärkten pro- inflammatorischen Stimulus. Die in vitro-Experimente mit neuronalen Zellkulturen (HT-22, neurale differenzierte Vorläuferzellen, primäre neuronale Mischkultur) zeigten, dass Neurone auch unter physiologischen Bedingungen keinen iP-Komplex synthetisieren. Die in vivo-Daten konnten dadurch bestätigt werden, dass das pro-inflammatorische Zytokin Interferon-gamma (IFNg) nur in den Gliazellen der primären Kulturen die de novo-Synthese des iPs induzierte. Es zeigte sich, dass die Bindungsstelle des Interferon-regulierenden Faktors 1 im neuronalen Promotor der für die Assemblierung und proteolytischen Aktivität des iPs essentiellen Untereinheit LMP7 methyliert vorliegt. In den primären, reifen Neuronen konnte eine Induktion der LMP7-Untereinheit in Abhängigkeit der Aktionspotential-Blockade mit dem Zytokin IFNg gezeigt werden. Überraschender-weise konnte in isolierten, primären Neuronen eine Korrelation zwischen der Oberflächen-expression des MHC I-Moleküls und der iP-Synthese beobachtet werden. Außerdem konnte eine Beteiligung des iPs an der synaptischen Plastizität dokumentiert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen erstmalig, dass unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen die Expression des Immunoproteasoms in Neuronen epigenetisch und in Abhängigkeit von der elektrischen Aktivität reguliert wird, und die wichtige Funktion des Immunoproteasoms während einer neurodegenerativen Erkrankungen daher auf seine Rolle in Gliazellen zurückzuführen ist.

The proteasome, one crucial component of the ubiquitin-proteasome system (UPS), assists as an ATP-dependent multi-catalytic protease in different essential processes of eukaryotic cells. The generation of peptides, which are presented on the cell-surface to CD8+ t-lymphocytes, is one of the main functions of the proteasome. A dysfunction of the UPS is connected to various neurodegenerative diseases. Under inflammatory stimuli the exchange of the catalytically active subunits, which transforms the constitutive proteasome into the inducible proteasome, results in the de novo synthesis of the immunoproteasome (iP). The iP implicates a more efficient peptide-generation for the MHC I complex caused by a higher protein-turnover. The inducible proteasome is known to be expressed in neural cells especially in neurodegenerative diseases. The precise function, however, has not been revealed so far in the cells of the central nervous system (CNS). Main focus of the investigations was to define the role of the iP in neural cells in in vitro and in vivo experiments under physiological and pathophysiological conditions like neuroinflammation. By the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in iP-deficient mice an earlier onset and higher severity of the disease in these animals was discovered. The de novo-synthesis of the iP was only observed in glia-cells but not in neurons during pro-inflammatory processes in the CNS. Animals without an iP-complex accumulated more poly- ubiquitin conjugates resulting in apoptosis and enhanced pro-inflammatory stimuli. In vitro experiments revealed that neuronal cells (HT-22, differentiated neural progenitor cells and primary neurons) do not synthesize the iP-complex under physiological conditions and by induction of the iP with the pro-inflammatory cytokine interferon-gamma (IFNg) in glia-cells the in vivo data was confirmed. Furthermore it was shown that the interferon regulatory factor 1 binding site of the neuronal promoter of the LMP7 subunit, which is essential for the assembly and the proteolytic activity of the iP, is methylated. Interestingly, inhibition of action potential combined with IFNg treatment lead to the synthesis of the iP-complex in electrically active neurons. In addition a correlation between the neuronal surface expression of the MHC I molecule and the de novo synthesis of the iP was also determined in isolated primary neurons. Aside from that the involvement of the inducible proteasome-complex in the synaptic plasticity was observed. IP-deficient neural cells were characterized by a diminished electrical activity under pro- inflammatory stimuli and an enhanced chemical long-term depression. This work shows for the first time, that in neurons the expression of the immuno- proteasome is regulated by epigenetic factors and electrical activity and that the important function of the iP during neurodegenerative diseases is attributed to its crucial role in glia-cells.