O-Glykosylierungen und Depsibindungen: Faltungsaspekte alpha-helikaler coiled coil-Peptide

Abstract

Die alpha-helikale coiled coil-Struktur ist eines der am häufigsten in der Natur vorkommenden Faltungsmotive, dass an einer Vielzahl von wichtigen Prozessen wie der viralen Membranfusion, der DNA Reparatur, der Muskelkontraktion und der Transkription beteiligt ist. De novo entworfene coiled coil-Peptide eignen sich aufgrund ihrer amphiphilen Natur und der bekannten Designprinzipien hervorragend als Modellsysteme für größere und komplexere biologisch relevante Proteine. Im Rahmen dieser Arbeit wurden de novo entwickelte coiled coil-Peptide verwendet, um verschiedene Aspekte der Proteinfaltung zu untersuchen. In Teil 1 wurde die kontextabhängige Bedeutung von Wasserstoffbrückenbindungen im Peptidrückgrat auf die Strukturbildung und Stabilität von Proteinen untersucht. Hierfür wurden Amidbindungen durch Esterbindungen ersetzt, um systematisch einzelne Wasserstoffbrücken zu eliminieren. Die thermodynamische Analyse der Depsipeptide, sowie die Moleküldynamik-Simulationen, zeigten, dass der Einfluss der Wasserstoffbrücken auf die Stabilität der Quartärstruktur in großem Maße von der Polarität der jeweiligen Umgebung abhängt. Im hydrophoben Milieu der Proteinumgebung sind die Wasserstoffbrücken wesentlich stärker als in solvatisierten Regionen des Proteinrückgrates. In Teil 2 wurde der Einfluss der multiplen O-Glykosylierung auf die Faltung und Stabilität der coiled coil-Struktur untersucht. Hierfür wurden in eine 26 Aminosäuren lange Peptidsequenz systematisch ein bis sechs β-D-Galactosereste über die Serinseitenketten in den Positionen b, c und f des Heptads eingeführt. Aufgrund der geometrischen Vorgabe des Heptad- Wiederholungsmusters können die Liganden in einem definierten Abstand zueinander präsentiert werden. Die Studie zeigte, dass die O-Glykosylierung mit β-D-Galactose ohne signifikante Stabilitätsverluste toleriert wird und das coiled coil-Faltungsmotiv daher großes Potential als multivalente Gerüststruktur hat. Um weite Rezeptorabstände zu überbrücken und die Valenz des coiled coil-basierten Gerüstes zu erhöhen, wurde ein fasernbildendes coiled coil-System entwickelt. Dieses besitzt eine einheitliche, aus Lysinresten bestehende elektrostatische Wechselwirkungsdomäne, die ein Überlappen der Helices ermöglicht. Anhand von coiled coil-basierten Modellpeptiden wurde in Teil 3 der Einfluss der O-Glykosylierung auf die Amyloidaggregation studiert. Hierfür wurden ein bis drei β-D-Galactosereste in verschiedene Positionen der Sequenz eingeführt. Die mehrfache Glykosylierung konnte die Amyloidbildung inhibieren, wohingegen die einfache Glykosylierung positionsabhängig nur zu einer Verzögerung der Amyloidbildung führte.

The alpha-helical coiled coil folding motif is one of the most common in nature, and is involved in many important biological processes including virus-host cell membrane fusion, DNA repair, muscle contraction, and transcription. De novo designed peptides that form coiled coils are suitable model systems for larger and more complex biologically relevant proteins because of their amphiphilic nature and well-known design principles. In this thesis, de novo designed coiled coil-forming peptides were used to investigate several aspects of protein folding. Part 1 describes the context-dependent relevance of backbone hydrogen bonds in protein folding and stability. For this purpose, amide bonds were replaced with ester bonds to systematically eliminate specific hydrogen bonds. Thermodynamic analysis and molecular dynamics simulations showed that the contribution of main chain hydrogen bonds to quaternary structure stability largely depends on the environment. In accordance with small molecule studies in solution, main chain hydrogen bonds are significantly stronger in the interior of the hydrophobic interface than they are in the solvent exposed aqueous regions of the coiled coil. The influence of multiple O-glycosylation on the folding and stability of coiled coils was the focus of part 2 of this thesis. One to six β-D-galactose residues were introduced as monosaccharides into a 26 amino acid peptide sequence via the serine side chains in positions b, c, and f of the heptad. The carbohydrate ligands are presented in a defined relative distance due to the geometric constrains of the heptad repeat. The study showed that O-glycosylation with β-D-galactose is well-tolerated and does not result in significant destabilization. Therefore, the coiled coil folding motif shows potential as a multivalent scaffold. Furthermore, to bridge long receptor distances and to extend the valence of the coiled coil-based scaffold, a fiber-forming coiled coil system was developed. In this system, the electrostatic recognition domain is composed exclusively of lysine residues, which enhances overlap between the helices. Part 3 describes the use of coiled coil-based model peptides to investigate the influence of O-glycosylation on amyloid formation. One to three β-D-galactose residues were introduced at different sites in the peptide sequence. Multiple glycosylation results in complete inhibition of amyloid formation. Interestingly, single glycosylation slows down the aggregation process in a manner that depends on the position in the peptide sequence.