Rolle des Chemerin-Chemerinrezeptorsystems in Glukosehomöostase und Neoplasie

Abstract

Eine frühzeitige Erkennung von Tumoren und Metastasen sowie die Krebsdiagnose bestimmt maßgeblich den Erfolg einer Krebstherapie. Das Targeting von G -Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) in Krebszellen ermöglicht die gezielte Visualisierung und selektive Behandlung von Target-positiven Tumorentitäten. Der Chemokine-like receptor 1 (CMKLR1) wird in Tumoren verschiedener Entitäten, wie zum Beispiel dem Plattenepithelkarzinom des Ösophagus und dem pankreatischen Adenokarzinom, überexprimiert. Stabilisierte Varianten von Chemerin-9 als Ligand von CMKLR1 wurden bereits in der Arbeitsgruppe entwickelt und deren Affinität bestätigt. Ziel dieser Dissertation war die Identifizierung neuer CMKLR1-positiver Tumorentitäten und die Charakterisierung der stabilisierten Chemerin-9-Sonden an CMKLR1-exprimierenden Xenografts für die bildgebende Diagnostik. Im Zuge dieser Dokorarbeit wurde eine Überexpression von CMKLR1 in der Brustkrebszelllinie DU4475 nachgewiesen. Expressionsanalysen an einem Tissue- Array verifizierten das Mammakarzinom als neue CMKLR1-positive Tumorentität. Durch Kombination der zwei optimierten Chemerin-9 Peptidanaloga mit verschiedenen Linkern und dem Nahinfrarotfarbstoff ITCC ergaben sich zehn Konjugate. In initialen optischen Imagingversuchen wurden diese an tumortragenden Nacktmäusen mit CMKLR1-positiven DU4475- und Target-negativen SW13-Xenografts getestet. Die vier Sonden mit dem höchsten Signalverhältnis zwischen CMKLR1-positiven und CMKLR1-negativen Tumorsignalen wurden durch die Kombination mit unspezifischen scrambled-Sonden auf ihre Target-Spezifität in der NIRF-Bildgebung in vivo weiter charakterisiert. Hieraus resultierte eine signifikante Target-spezifische Anreicherung von zwei Chemerin-9-basierten Sonden in den CMKLR1-positiven DU4475-Tumoren. Die in vivo Tumorakkumulation der Konjugate war abhängig von deren physikochemischen Eigenschaften. Exemplarische klinische Anwendungsmöglichkeiten der hochaffinen, optimierten Chemerin-Sonden liegen in der Mammografie und der intraoperativen Bildgebung. Ein weiteres Ziel dieser Doktorarbeit war die Untersuchung des Einflusses von Chemerin auf die Glucagonsekretion. Aus der Literatur war bekannt, dass Chemerin im Pankreas exprimiert wird und den Fettstoffwechsel sowie die Glukosehomöostase beeinflusst. CMKLR1 konnte außerdem in unserer Arbeitsgruppe auf humanen pankreatischen α-Zellen nachgewiesen werden. Weder Glucagon- noch Insulin-Sekretionsassays an pankreatischen Nagerzelllinien zeigten einen Einfluss von Chemerin, obwohl eine Rezeptorexpression auf mRNA-Ebene nachgewiesen wurde. Als Organismus-bezogeneres System wurden Sekretionsuntersuchungen an primären humanen pankreatische Inseln durchgeführt. Auch hier wurde kein Einfluss von Chemerin auf die Glucagon- sowie Insulin-Sekretion nachgewiesen. Nur Inseln von zwei der vier getesteten Patienten zeigten eine physiologische Antwort in der Insulinsekretion. Durch unterschiedliche Glukosekonzentrationen im Zellkulturmedium konnte keine veränderte Glucagonsekretion festgestellt werden. Damit konnte in vitro das biologische Verhalten nicht nachgebildet werden. Expressionsanalysen an den pankreatischen Inseln bestätigten sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene das Vorhandensein von CMKLR1, wobei immunhistochemische Färbungen die Ko- Lokalisation von CMKLR1 und den Glucagon-exprimierenden α-Zellen verifizierten. Für die Bestätigung der Theorie, ob CMKLR1 ein Target für α-Zellen darstellt und somit für die Behandlung von Diabetes mellitus geeignet ist, ist ein funktionierendes experimentelles System Voraussetzung. Die hier beschriebenen Inseln zeigten keine physiologische Resonanz und es konnte bis dato keine weitere Bezugsquelle für humane pankreatische Inseln gefunden werden.

Early detection of tumors and metastases and cancer diagnosis are essential for a successful cancer therapy. The targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) in cancer cells enables the targeted visualization and selective treatment of target-positive tumors. The chemokine-like receptor 1 (CMKLR1) is overexpressed in different tumor entities, such as esophageal squamous cell carcinoma and pancreatic adenocarcinoma. Stabilized variants of chemerin-9, a ligand of CMKLR1, have already been developed in the group. The aim of this thesis was the identification of novel CMKLR1-expressing tumor entities and to characterize stabilized chemerin-9 probes on CMKLR1-positive xenografts for diagnostic imaging approaches. Overexpression of CMKLR1 was detected in the mamma cacinoma cell line DU4475. Tissue array analysis verified breast cancer as a new CMKLR1-positive tumor entity. Through combination of the two optimized chemerin-9-based peptide analogs with different linkers and the nearinfrared dye ITCC, ten conjugates were developed. In initial optical imaging experiments, they were tested on tumor-bearing nude mice with CMKLR1-positive DU4475- and target-negative SW13 xenografts. By combination with non-specific scrambled probes, the four probes with the highest ratio between CMKLR1-positive and CMKLR1-negative tumor signals were further characterized regarding their target specificity. This resulted in a significant, target-specific accumulation of two chemerin-9 probes in the CMKLR1-positive DU4475 tumors. The in vivo tumor accumulation of the conjugates was dependent on their physicochemical properties. Clinical applications of the optimized chemerin peptid probes could be mammography and intraoperative imaging. Another aim of this thesis was to investigate the impact of chemerin on glucagon secretion. It was published that chemerin is expressed in the pancreas and affects fat metabolism and glucose homeostasis. Furthermore, CMKLR1 could be detected in human pancreatic α-cells. Neither glucagon nor insulin secretion analysis with pancreatic rodent cell lines showed an impact of chemerin although a receptor expression (mRNA) was detectable. Further secretion studies were performed on primary human pancreatic islets as an organism-homologous system. Again, no influence of chemerin on the glucagon and insulin secretion was detected. Islets of two of the four tested patients showed a physiological response of insulin secretion. Different concentrations of glucose did not alter glucagon secretion. Thus, the biological response could not be reproduced in vitro. Analysis of the pancreatic islets confirmed both at the mRNA and the protein level, the presence of CMKLR1. By immunohistochemical stainings, colocalization of CMKLR1 and the glucagon expressing α-cells was verified. To confirm that CMKLR1 is a promising target for α-cells and suitable for the treatment of diabetes mellitus, a reliable experimental system is required. The tested islets did not show a physiological response and for now no other source of human pancreatic islets could be identified.