Nicht kodierende RNAs in der Knochenentwicklung

Abstract

Einleitung: MiRNAs als Teil nicht kodierender RNAs stellen potente Modulatoren der intrazellulären Signaltransduktion dar. Viele Studien der Knochenbiologie beschäftigen sich mit der Wirkung von miRNAs auf einzelne Ziel-mRNAs oder auf deren differenzielle Expression nach osteogener Induktion von Vorläuferzellen oder nach Signalwegaktivierung. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass der miR-497-195 Cluster als intrazellulärer BMP-Antagonist wirkt, der die BMP- Signalkaskade an multiplen Stellen beeinflusst. Ergebnisse: Der miR-497-195 Cluster ist der bedeutendste Vertreter der miR-15-Familie in der postnatalen Knochenentwicklung in vivo und im Verlauf der späteren Osteoblastendifferenzierung in vitro. Nach Überexpression von miR-195-5p in murinen Osteoblasten kommt es zu einer verzögerten Differenzierung und Mineralisierung. Mit Hilfe von Genexpressions-Mikroarrays und Q-PCR konnte gezeigt werden, dass es durch miR-195-5p Überexpression zu einer reduzierten Induktion BMP-responsiver Gene kommt. Eine Dosisabhängigkeit der BMP-Antwort in Abhängigkeit des Grades der miR-195-5p Überexpression wurde durch Luciferase Experimente mit BMP-sensitiven Reporterkonstrukten und Western Blots auf phospho Smad1/5/8 bestätigt. Die Induktion BMP-responsiver Gene nach BMP2-Zugabe war sowohl bei Osteoblasten erniedrigt, in denen miR-195-5p überexprimiert wurde, als auch in untransfizierten Zellen eines späteren Differenzierungsstadiums, in welchem der miR-497-195 Cluster endogen hochreguliert ist. Schlussfolgerung: Diese Arbeit stellt eine wesentliche Grundlage für die Untersuchung des miR-497-195 Clusters im Tiermodell dar. Eine Hemmung dieses hier erstmals identifizierten intrazellulär wirkenden BMP- Antagonisten könnte eine BMP2-basierte Behandlung von Problemfrakturen hilfreich unterstützen.

Introduction: MiRNAs are noncoding RNAs that represent a powerful modulator of signal transduction. In bone cell biology many microRNA-studies focused on single miRNA-target interactions or differential miRNA expression after osteogenic induction of precursor cells or upon pathway activation. Here we present evidence that the miR-497-195 cluster microRNAs antagonize BMP signaling by downregulation of numerous genes that are part of this signaling cascade. Results: The miR-497-195 cluster is the most prominent member of the miR-15 family in postnatal bone development in vivo and during later stages of osteoblast differentiation in vitro. An inhibitory effect on differentiation and mineralization was observed when miR-195-5p was overexpressed in murine osteoblasts. Using gene expression array experiments and quantitative PCR we demonstrate that miR-195-5p overexpression leads to reduced induction of BMP- responsive genes. A dose dependent impact of miR-195-5p overexpression on BMP- response was confirmed by Luciferase assays based on Bmp-response element containing reporter constructs and by phospho-Smad1/5/8 Western blots. Induction of Bmp-responsive genes following BMP2 treatment was not only reduced upon overexpression of miR-195-5p, but also at later stages of osteoblast differentiation, were we observed endogenous upregulation of the miR-497-195 cluster. Conclusion: Based on this work we plan further investigation of the miR-497-195 cluster in an animal model. Inhibition of the intracellular acting BMP-antagonist might be a useful therapeutic option to support treatment with recombinant BMP2 to promote healing of non-unions and large-size defects.