Entwicklung rekombinanter Alpha 1-Antitrypsin-Neoglykoproteine: Einfluss von zusätzlichen N-Glykosylierungsmotiven, nicht natürlichen Monosacchariden und verschiedenen Expressionssytemen auf die Serumhalblebenszeit und Bioaktivität

Abstract

Das Serumglykoprotein Alpha 1-Antitrypsin (A1AT) hat durch seine inhibitorische Aktivität gegenüber der Neutrophilen Elastase eine besondere physiologische Bedeutung in der Lunge. Bei der A1AT-Mangel-Erkrankung kommt es bei Patienten zu einer gesundheitsgefährdenden niedrigen Konzentration des Serinprotease-Inhibitors und einer erhöhten Gefahr, an einem Lungenemphysem zu erkranken. Zurzeit werden Patienten mit A1AT behandelt, welches aus humanem Plasma isoliert wird. So besteht stets die Gefahr einer Infektion. Patienten müssen aufgrund der schnellen Degradation von A1AT wöchentlich zur Behandlung erscheinen, um ein schützendes Level an A1AT im Serum aufrecht zu erhalten. Eine bedeutende postranslationale Modifikation für die Serumhalblebenszeit wird in der Glykosylierung von Serumglykoproteinen gesehen, da Asialoglykoproteine vom Asialoglykoproteinrezeptor in der Leber erkannt und aus der Zirkulation entfernt werden. Deshalb ist die Sialylierung vieler Glykokonjugate essenziell für deren Stabilität im Serum. In dieser Arbeit wurden zusätzliche N-Glykosylierungsstellen mittels gerichteter Mutagenese PCR in die A1AT-CDS eingefügt, um eine erhöhte molekulare Masse und eine gesteigerte negative Ladung, vermittelt durch terminale Sialinsäuren, zu erreichen. Die zusätzlichen N-Glykane liefern zudem ein gegen proteolytische Enzyme besser abgeschirmtes A1AT-Glykoprotein. Die eingefügten N-Glykosylierungsstellen wurden für die Anheftung von N-Glykanen genutzt, wobei die inhibitorische Aktivität der A1AT-Varianten erhalten werden konnte. A1AT-Expressionen aus verschiedenen Zelllinien (HEK293, HEK293-SialT/GalT, AGE1.HN, CHO) wurden anhand ihrer N-Glykane mittels MALDI-TOF-MS, HPLC- und CE-LIF untersucht. Der Vergleich verschiedener Expressionssysteme zeigt eine zelllinienspezifische, jedoch proteinbestimmte N-Glykanausstattung von A1AT. Die Expression der A1AT-Varianten in AGE1.HN-Zellen war möglich und führte, neuronalen Zellen entsprechend, zur Verknüpfung komplexer N-Glykane mit einem erhöhten Fucosylierungsgrad. Als besondere Glykanstrukturen wurden in Expressionen aus HEK293-Zellen terminale GalNAc-Reste, β (1-4)/β (1-3) Galactose-Tetraisomere und eine C-Mannosylierungsstelle für A1AT nachgewiesen. Nach Einfügen zusätzlicher N-Glykosylierungsmotive konnte eine Ausstattung mit höher antennären Strukturen beobachtet werden. Erste präklinische Daten wurden anhand der pharmakokinetischen Eigenschaften in der CD-1-Maus ermittelt. Der Einfluss von A1AT auf die Invasivität einer Lungentumorzelllinie (A549) und Neutrophile wurde mittels in vitro Tests gewonnen. Die Halbwertzeiten der A1AT-Varianten aus HEK293-Zellen in der CD-1-Maus konnten erhöht werden. Für die A1AT-Variante N123 zeigte sich eine Steigerung um 29 min (von 47 min auf 76 min). Die rekombinanten A1AT-Varianten hatten keinen Einfluss auf die Aktivität von Neutrophilen und auf das invasive Potenzial von humanen Lungentumorzellen. Die gezielte Modifikation der N-Glykane mit nicht natürlichen Monosacchariden (2dGal und ManNProp) sollte auf den Einfluss auf die Sialidaseresistenz untersucht werden. Die Ergebnisse zur Serumhalblebenszeit aus der CD-1-Maus und aus dem Neuraminidase-Assay sprechen für einen geringfügigen Einfluss der Analoga auf die Sialidaseresistenz. Durch die Überexpression von β (1-4) Galactosyltransferase und α (2-6) Sialyltransferase in HEK293-Zellen konnte in dieser Arbeit eine vollständigere Sialylierung und Galactosylierung erreicht werden. Zudem zeigen die Ergebnisse zur Serumhalblebenszeit eine weitere Senkung der Clearance-Rate. Die verwendeten Techniken stellten sich als ein geeignetes Werkzeug zur Verbesserung der Serumhalblebenszeit von A1AT dar. Weiterführende Arbeiten sind in Hinblick auf eine Aufklärung der biologischen Bedeutung der GalNAc- Struktur und der β (1-3) Galactose-Tetraisomere in N-Glykanen aus A1AT sowie der C-Mannosylierung geplant. Eine Untersuchung von A1ATwt und ausgewählten A1AT-Varianten in einem A1AT-defizienten Mausmodell würde aufklären, ob die in vivo Aktivität beeinflusst ist. Zudem soll ein Langzeitversuch zeigen, inwiefern das rekombinante A1AT immunogenen Einfluss besitzt, wenn es mehrfach appliziert wird. In diesem Zusammenhang sollen ebenfalls deutlich höhere Dosen von A1AT eingesetzt werden, um einen unerwünschten Nebeneffekt der Neoglykoproteine auszuschließen.

Alpha 1-Antitrypsin (A1AT) is a human serum glycoprotein with the main biological function as inhibitor of neutrophil elastase in the lung. A1AT- deficiency leads to lower levels of the serine protease inhibitor which increases the risk of developing emphysema in lungs. Currently, patients undergo augmentation therapy with A1AT derived from human serum. This presents several disadvantages like the risk of infections. In addition, weekly treatment intervals are needed to keep a protective level of A1AT in serum. Glycosylation is an important post-translational modification of proteins regarding serum half-life. Sialylation is essential to ensure the stability of glycoconjugates in serum as asialoglycoproteins are recognized by the asialoglycoprotein receptor to be removed from circulation. Using site directed mutagenesis PCR, additional N-glycosylation sites were introduced into the coding sequence of A1AT in order to increase molecular mass and to raise the degree of sialylation. The additional N-glycans are expected to enhance the protection of proteins against proteolytic enzymes. The additional N-glycosylation sites were used and the inhibitory activity of A1AT variants remained the same. A1AT was expressed using different cell lines, namely HEK293, HEK293-SialT/GalT, AGE1.HN and CHO, N-glycans were released and investigated using MALDI-TOF-MS, HPLC and CE-LIF. Comparison of the N-glycan expression systems reveals cell-line-specific and also protein-specific features. The expression of A1AT-variants in AGE1.HN cells led to the linkage of complex N-glycans with neuronal characteristics. In particular, A1ATwt and variants expressed in HEK293 cells exhibited N-glycans with terminal GalNAc residues and with β (1-4)/β (1-3) linked galactose. The presence of C-mannosylation was established in A1ATwt expressed in HEK293 cells. Introduction of additional N-glycosylation sites led to a higher degree of antennarity. Pharmakokinetical tests were carried out in CD-1-mice and the influence of A1AT on invasiveness and neutrophils was examined via in vitro testing. Serum half-life could be increased for A1AT variants in CD-1-mice; the N123 A1AT variant exhibited a 29-min increase (from 47 to 76 min). We also demonstrated that recombinant A1ATwt does neither affect neutrophils nor the invasiveness of the human lung tumor cell line (A549). The modification of N-glycans by artificial precursors (2dGal and ManNProp) was investigated for its resistance towards sialidase. The serum half-life in CD-1-mice and the results of the neuraminidase assay show a minor influence of analogues on sialidase resistance. Overexpression of β (1-4) galactosyltransferase and α (2-6) sialyltransferase resulted in a complete galactosylation and sialylation of N-glycans. Additionally, the clearance rate could be further reduced. To summarize, the techniques presented in this work are potent tools to improve the serum half-life of A1AT. Further experiments could focus on the biological function of terminal GalNAc residues, of β (1-3) linked galactose and of C-mannosylation in A1AT. The analysis of A1ATwt and selected A1AT variants using an A1AT-deficient mouse model would clarify the impact of additional N-glycosylation sites on in vivo activity. In addition, a long term study could evaluate the tolerance of the recombinant antiprotease A1AT after repeated applications using various concentrations.