Long-lasting activation of extracellular signal-regulated kinases 1/2: importance of G protein-coupled receptor localisation and transcriptional responses

Abstract

Despite compelling evidence that the phenotypic modulation of vascular smooth muscle (VSM) cells plays a key role in the development and progression of arteriosclerosis, we are just beginning to unravel the molecular mechanisms and factors that control this process. It is proposed that the duration of an epidermal growth factor receptor (EGFR)-mediated ERK1/2 (extracellular signal- regulated kinases 1/2) phosphorylation controls the phenotypic outcome of a cell. In that context, long-lasting ERK1/2 kinetics, as opposed to short-lived kinetics, have been linked to cellular differentiation in various cell types. However, the exact mechanisms controlling the activation of ERK1/2 are still not fully understood. This study sought to understand the phosphorylation kinetics of ERK1/2 by focusing on two different aspects. The endothelin B (ETB) receptor is a G protein-coupled receptor (GPCR) mainly expressed in endothelial cells. In diseased states, however, it is highly upregulated in VSM cells, suggesting an important role during the development of arteriosclerosis. Upon ligand binding the ETB receptor can undergo a proteolytic N-terminal cleavage resulting in an unglycosylated, truncated receptor. It was investigated whether the ETB receptor processing affects its localisation to plasma membrane microdomains and whether the localisation of the receptor has an impact on its mitogenic signalling in COS7, HEK293 and MDCK cells. The subcellular localisation of various ETB receptor constructs, EGFR ligands and the EGFR itself was analysed by performing detergent-free caveolae preparations and total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Furthermore, the ETB receptor-induced ectodomain shedding of EGFR ligands and the subsequent transactivation of the EGFR and its downstream signalling was investigated by performing shedding assays and ERK1/2 phosphorylation analyses. In COS7 cells, the N-terminally truncated but not the full-length or glycosylation-deficient ETB receptor localised to caveolae. In contrast, in MDCK cells, only the full-length ETB receptor was enriched in caveolae. In HEK293 cells, which do not form caveolae, only ETB receptor constructs that were fused to caveolin-2, localised to low-density plasma membrane microdomains. When accumulated in caveolae, activation of the ETB receptor disfavoured the shedding of EGF receptor ligands in COS7 cells. Nonetheless, the activation of ERK1/2 was efficient and long lasting. In HEK293 cells, the shedding activity was impaired by N-terminal truncation but not by simple removal of glycosylation of the ETB receptor. The subsequent ERK1/2 phosphorylation was long lasting only for the full-length ETB receptor. In MDCK cells, activation of ERK1/2 was monophasic irrespective of a caveolar accumulation of the ETB receptor. It can be concluded that the receptor localisation within plasma membrane microdomains is cell type-specific. In addition, a caveolar enrichment of ETB receptors does not facilitate the release of EGF receptor ligands. Taken together these results suggest that cell type-specific mechanisms beyond receptor structure and localisation determine the kinetic properties of ERK1/2 phosphorylation. Since the cellular background is based on protein composition and transcriptional responses, a genome-wide microarray approach was used to analyse the molecular basis of a long-lasting ERK1/2 phosphorylation in VSM cells. The protease-activated receptors (Par)-1 and -4 of neonatal rat aortic VSM cells were stimulated with thrombin, with a Par-1-selective thrombin receptor-activating peptide (TRAP), and with TRAP upon treatment with Gi-uncoupling pertussis toxin for 2 h to focus on mechanisms that may contribute to the induction of a long-lasting activity of ERK1/2. Gene expression was compared to unstimulated VSM cells and analysed using confidence analysis. Of the 31099 genes screened, 141 differentially regulated genes could be mapped to known signalling pathways of the KEGG pathway database. Special focus was laid on prothrombotic and MAPK signalling pathways of which 32 genes were regulated (22 upregulated genes) upon stimulation of Par-1 or Par-4. Among them were the EGFR ligands amphiregulin and HB-EGF (heparin-binding EGF-like growth factor), extracellular matrix components, MAPKs and their inhibitors, transcription factors, and plasminogen activator inhibitors. Five genes, namely amphiregulin, MAP3K8, ADAMTS (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif)-1, TIMP (tissue inhibior of metalloproteinases)-1 and COX (cyclooxygenase)-2 were investigated in more detail and their expression was reassessed by RT-PCR and immunoblot analyses. The data obtained from the microarray studies suggest novel important roles for amphiregulin, ADAMTS-1, MAP3K8, TIMP-1 and COX-2 in the phenotypic modulation of VSM cells. They might function as intermediates in the expression of contractile proteins. For future experiments, the role of the differentially regulated genes in the long-lasting activation of ERK1/2 and subsequent phenotypic modulation of VSM cells needs to be addressed by performing siRNA experiments or by applying small molecules that selectively inhibit the addressed protein. These approaches may help to better understand and also to prevent the progression of arteriosclerosis.

Obwohl bekannt ist, dass eine phänotypische Veränderung glatter Gefäßmuskelzellen zur Entstehung und Entwicklung von Arteriosklerose beiträgt, so sind die molekularen Grundlagen dieser Veränderung noch immer nicht vollständig aufgeklärt. Eine Hypothese besagt, dass die Dauer einer EGF (epidermal growth factor)-Rezeptor-vermittelten Phosphorylierung der MAP (mitogen-activated protein)-Kinasen ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1/2) diesen Prozess kontrolliert. In diesem Zusammenhang wurde für verschiedene Zelltypen gezeigt, dass eine lang anhaltende Aktivierung von ERK1/2 zu einer Differenzierung von Zellen führt, während eine nur kurzlebige Aktivierung die Proliferation einer Zelle begünstigt, jedoch ist der genaue Mechanismus weiterhin nicht vollständig aufgeklärt. Diese Arbeit zielte darauf ab die verschiedenen Kinetiken der ERK1/2 Phopshorylierung aus zwei verschiedenen Gesichtspunkten zu analysieren. Der Endothelin B (ETB) Rezeptor gehört zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und wird hauptsächlich in Endothelzellen exprimiert. Einzig für Krankheitszustände wie Arteriosklerose wurde gezeigt, dass der Rezeptor auch in glatten Gefäßmuskelzellen sehr stark exprimiert wird und somit eine wichtige Rolle in der Entwicklung dieser Krankheit spielen könnte. Nachdem der Rezeptor seinen Liganden gebunden hat, erfährt er eine N-terminale Proteolyse, wodurch ein verkürzter und unglycosylierter Rezeptor entsteht. In COS7-, HEK293- und MDCK- Zellen wurde untersucht, ob diese Rezeptorprozessierung einen Einfluss auf die Lokalisation des Rezeptors in Plasmamembran-Mikrodomainen hat und ob dies seine Signaltransduktion beeinflusst. Mittels detergensfreier Präparation von Caveolae sowie TIRF (total internal reflection fluorescence)-Mikroskopie wurde die subzelluläre Lokalisation verschiedener ETB-Rezeptorkonstrukte sowie des EGF-Rezeptors und dessen Liganden untersucht. Weiterhin, wurde das ETB- Rezeptor-induzierte Spalten (Shedding) von EGF-Rezeptorliganden und die anschließende Transaktivierung des EGF-Rezeptors sowie die Aktivierung von ERK1/2 analysiert. Während in COS7-Zellen der gespaltene, jedoch nicht der ungespaltene ETB-Rezeptor in Caveolae angereichert war, zeigte der ungespaltene ETB-Rezeptor eine caveoläre Anreicherung in MDCK-Zellen. In HEK293-Zellen, welche keine Caveolae bilden, war der ETB-Rezeptor nur dann in Plasmamembran-Mikrodomänen angereichert, wenn er mit Caveolin-2 fusioniert war. Stimulation eines caveolär akkumulierten ETB-Rezeptors resultierte in COS7-Zellen in einem weniger effizienten Shedding von EGF-Rezeptorliganden. Die Aktivierung von ERK1/2 war jedoch unabhängig von der Lokalisation effizient und lang anhaltend. In HEK293-Zellen war die Shedding-Aktivität zusätzlich von der N-terminalen Proteolyse des ETB-Rezeptors, jedoch nicht vom Glykosylierungsstatus des Rezeptors beeinflusst. Die anschließende Phosphorylierung von ERK1/2 war aber nur lang anhaltend, wenn der Rezeptor nicht prozessiert wurde. In MDCK-Zellen hatte die Prozessierung des ETB- Rezeptors keinerlei Einfluss auf die Aktivierung von ERK1/2. Diese war stets kurzlebig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass eine zelltyp-spezifische Lokalisation des ETB-Rezeptors vorliegt. Zusätzlich scheint eine caveoläre Anreicherung des ETB-Rezeptors das Shedding von EGF-Rezeptorliganden nicht zu begünstigen. Schlussfolgernd kann gesagt werden, dass neben den zelltyp- spezifischen Rezeptorformen und -lokalisationen auch andere Faktoren die Kinetiken der ERK1/2-Phosphorylierung beeinflussen. Da auch das zelluläre Proteom sowie transkripitionelle Mechanismen die Signaltransduktion beeinflussen, wurde genomweit untersucht, inwiefern eine Par-1 und -4-induzierte lang anhaltende ERK1/2-Aktivierung transkriptionell reguliert wird. Die Proteinase-aktivierten Rezeptoren (Par)-1 und -4 neonataler Gefäßmuskelzellen der Ratte wurden mit Thrombin, einem Par-1-selektiven Thrombin-Rezeptor-aktivierenden Peptid (TRAP) sowie mit TRAP nach Vorbehandlung mit Pertussistoxin, einem Gi-Inhibitor, für 2 h stimuliert. Die Genexpression dieser Proben wurde mit der in unbehandelten Gefäßmuskelzellen verglichen und mittels Konfidenzanalyse analysiert. 31099 Gene wurden untersucht, wovon 141 differentiell regulierte Gene verschiedenen Signaltransduktionswegen aus der KEGG-Datenbank zugeordnet werden konnten. Besonderer Fokus galt den prothrombotischen und den MAP-Kinase-Signalwegen, denen 32 differentiell regulierte (22 hochregulierte) Gene zugeordnet werden konnten. Zu ihnen gehörten die EGF-Rezeptorliganden Amphiregulin und HB-EGF (heparin-binding EGF-like growth factor), extrazelluläre Matrixkomponenten, MAP-Kinasen und deren Inhibitoren sowie Plasminogenaktivator-Inhibitoren. Die fünf Gene Amphiregulin, MAP3K8, ADAMTS (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif)-1, TIMP (tissue inhibitor of metalloproteinases)-1 und COX (Cyclooxygenase)-2 wurden genauer analysiert und ihre Expression wurde mittels RT-PCR und Immunoblot bestimmt. Die durch die Genchip-Analysen erhaltenen Daten deuten darauf hin, dass Amphiregulin, ADAMTS-1, MAP3K8, TIMP-1 und COX-2 eine wichtige Rolle in der phänotypischen Modulation von glatten Gefäßmuskelzellen spielen. Sie könnten wichtige Intermediate bei der Expression kontraktiler Proteine darstellen. In weitergehenden Experimenten sollte die Rolle dieser Proteine in der lang anhaltenden Aktivierung von ERK1/2 durch siRNA oder kleine inhibitorische Moleküle weiter untersucht werden. Diese Ansätze könnten zu einem besseren Verständnis der Entstehung von Arteriosklerose führen und neue Möglichkeiten liefern, eine Progression zu verhindern.