Vergleich der Wirkungen von Levofloxacin und Moxifloxacin auf Sehnenzellen vom Menschen in vitro und Antagonisierung der Effekte mit N-Acetylcystein

Abstract

Chinolone werden seit geraumer Zeit zur Therapie bakterieller Infektionen eingesetzt. Mit ihnen können nicht nur lokale Infektionen, wie zum Beispiel der Atemwege und des Urogenitalsystems erfolgreich therapiert werden. Auch systemische Infektionen sind mit Hilfe der Chinolone sehr gut zu behandeln. Die hervorragende Knochen– und Weichteilgängigkeit dieser Substanzen ermöglicht auch das Behandeln von Infektionen in, mit herkömmlichen antimikrobiellen Chemotherapeutika, schwer zu erreichenden Kompartimenten. Die Stoffklasse der Chinolone zeichnet sich außerdem durch eine noch relativ gute Resistenzlage aus. Als eine schwerwiegende Nebenwirkung ist schon seit geraumer Zeit das sehnenschädigende Potential der Chinolone bekannt. Diese Nebenwirkung tritt sehr selten auf und variiert in ihrer Ausprägung. Die daraus resultierenden Symptome reichen von einer unspezifischen Tendinitis bis hin zur Ruptur der Sehne. Der genau zugrunde liegende Pathomechanismus ist aber immer noch weitgehend unklar, wenn auch diverse Theorien bestehen. Bei steigender Zahl der Fallberichte und daraus folgenden Untersuchungen, konnte sich ein Spektrum für gewisse Risikofaktoren ableiten lassen. Als solche zählen: Alter des Patienten, gleichzeitige oder zeitnahe Applikation von Glukokortikoiden und das Bestehen einer Niereninsuffizienz. Gleichwohl konnte in retrospektiven klinischen und auch in in vitro Versuchen gezeigt werden, dass verschiedene Chinolone ein unterschiedliches Potential für diese unerwünschte Wirkung besitzen. Ziel dieser Arbeit war es, folgende Fragestellungen mit Hilfe von Untersuchungen an Zellkulturen zu überprüfen: 1\. Unterscheiden sich Levofloxacin und Moxifloxacin in ihrem Potential einen Sehnenschaden zu erzeugen? 2\. Ist der tendotoxische Effekt von Levofloxacin durch die gleichzeitige Anwendung von N-Acetylcystein zu beeinflussen? Um diese Fragestellungen zu beantworten, wurden humane Tendozyten mit den Substanzen als Primärkultur in Monolayern inkubiert. Die Inkubation erfolgte über 5 Tage entweder nur mit einem der beiden Chinolone oder, im zweiten Ansatz, in Kombination mit N-Acetylcystein. Die Analyse erfolgte anschließend mittels Western Blot und mit Hilfe der Immunhistochemie. Untersucht wurde der Effekt auf sehnenspezifische Proteine, die einerseits den Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix bilden (Collagen Typ I) und andererseits für Proteine, welche verantwortlich für die Integrität der Sehnenzellen in der Sehne sind (β1-Integrine, Fibronectin). Für den Vergleichsansatz zwischen Levofloxacin und Moxifloxacin konnte mittels Western Blot gezeigt werden, dass schon in der geringst gewählten Konzentration (10 mg/l) eine Abnahme aller getesteten Proteine erfolgte. Dies galt für beide untersuchten Chinolone. Eine unterschiedliche Ausprägung des Effektes zwischen den Chinolonen, ließ sich mit den Ergebnissen aus den Western Blot Versuchen nicht aufzeigen. In der immunhistochemischen Untersuchung konnte gezeigt werden, dass der Effekt auf Collagen Typ I schon in einer Konzentration von 3 mg/l nachzuweisen war. Ein Unterschied zwischen den beiden Chinolonen war auch hier nicht zu ermitteln. Zur Klärung der zweiten Fragestellung wurden ebenfalls beide Verfahren angewandt. Im Western Blot zeigte sich, dass die Ko-Inkubation mit NAC eine Abschwächung der Proteinreduktion erzeugte. Dies galt für beide untersuchten Konzentrationen von Levofloxacin (30 mg/l und 100 mg/l). Der Effekt der alleinigen NAC-Inkubation (1 mmol/l) zeigte keinen signifikanten Unterschied zur Kontrolle, erreichte aber nie gänzlich das Kontrollniveau. Dies bestätigt die Annahme, dass NAC allein kein tendotoxisches Potential besitzt. Die für den zweiten Ansatz modifizierte immunhistochemische Analyse untersuchte, inwiefern sich der Effekt auf Collagen Typ I bei einer Konzentrationsabnahme von NAC ändert. Es konnte gezeigt werden, dass bei einer Konzentrationsabnahme von NAC in der Kombination mit Levofloxacin 30 mg/l zunehmend weniger Collagen Typ I nachgewiesen werden konnte. Der tendotoxische Effekt von Levofloxacin trat also immer stärker hervor. Abschließend lässt sich aus den gewonnenen Daten ableiten, dass sich mit dem in dieser Arbeit verwendeten Modell keine unterschiedliche Potenz für Levofloxacin und Moxifloxacin hinsichtlich ihrer tendotoxischen Wirkung zeigen lässt. NAC konnte in simultaner Inkubation den sehnenschädigenden Effekt von den untersuchten Chinolonen abschwächen. Dieser protektive Effekt ist konzentrationsabhängig und hebt den erzeugten Schaden an der Sehnenzelle nie vollständig auf. Da es sich hierbei um in vitro Versuche handelt, müssten für genauere Angaben hinsichtlich der hier erörterten Fragestellungen weitere in vivo Versuche erfolgen, um letztendlich eine Aussage treffen zu können, inwiefern NAC ein protektiven Effekt bei Chinolongabe zur Vermeidung einer Tendopathie besitzen kann.

Quinolones have been used successfully for the treatment of bacterial infections since many years. Often they are used for the treatment of respiratory tract or urinary tract infections. However, they can be used for systemic infections as well. The favourable pharmacokinetics and excellent tissue penetration of the quinolones into deep compartments such as bone an skin and soft tissues make it possible to treat infections which are difficult to treat with other antimicrobial agents. Overall, the resistance situation for quinolones still is quite favourable. Tendotoxic effects as an example of a serious adverse effect associated with quinolone use has been known for approximately two decades. This side effect is rare and the clinical symptoms are variable reaching from mild tendinitis to tendon rupture. The exact underlying pathomechanism is still unclear, although several theories have been published. An increasing number of case reports made it possible to define some risk factors for the development of a quinolone-induced tendopathy such as age of the patient over 60 years, concomitant treatment with corticosteroids and underlying chronic renal disease. Data derived from retrospective clinical studies as well as from some in vitro experiments showed that the quinolones differ with respect to their potential to induce this adverse effect. This in vitro work was performed to test the following questions: 1\. Do levofloxacin and moxifloxacin differ in their potential to induce a tendopathy? 2\. Can the tendotoxic effect of levofloxacin be influenced by N-acetylcysteine? Primary monolayer cultures of human tendocytes were incubated with the test compounds for 5 days. Firstly, the two quinolones were compared or secondly, they were cultured together with N-acetylcysteine. Cell analysis was performed by Western Blotting and immunohistochemistry for tendon-specific proteins such as collagen type I, representing the major component of the extracellular matrix or β1-integrins and fibronectin which are necessary for the integrity and cell-matrix interaction in the tendon. As decrease of all tested proteins was shown by Western Blotting for moxifloxacin and levofloxacin already at the lowest concentration tested (10 mg/l). No difference was recognized under these experimental conditions between the two quinolones. Also by immunohistochemistry changes of the collagen type I concentrations were observed with both quinolones to a similar extent but at lower concentrations (3 mg/l). Both methods, Western Blotting and immunohistochemistry, were also used to investigate the effects of N-acetylcysteine on the quinolone-induced changes. Co-incubation with N-acetylcysteine weakened the levofloxacin-induced effects, i.e. the reduction of tendon-specific proteins, at both concentrations tested (30 and 100 mg/l). N-acetylcysteine alone at a concentration of 1 mmol / l caused a slight, but not significant, effect supporting the assumption that N-acetylcysteine itself exhibits no tendotoxic potential. The concentration dependency of the antagonistic effect of N-acetycysteine on the quinolone-induced collagen reduction was studied by immunohistochemistry. By using a fixed concentration of 30 mg levofloxacin / l medium and a stepwise reduction of the concentration of N-acetylcysteine collagen type I concentrations decreased. In other words, with decreasing concentrations of N-acetylcysteine the tendotoxic effect of levofloxacin was gradually enhanced. In summary, with the given experimental conditions no differences between the potency of the tendotoxic effects of levofloxacin and moxifloxacin could be demonstrated. N-acetylcysteine reduced the tendotoxic effects when the cells were co-exposed to this agent and a quinolone. This antagonistic effect was concentration dependent, but a complete abolishment of the quinolone-induced toxicity was not achieved. Keeping in mind that these experiments were performed in vitro further in vivo studies are necessary to definitely answer the question if N-acetylcysteine exhibits a protective effect and could be used together with quinolones to avoid quinolone-induced tendotoxicity.