Risikoabschätzung von porzinen Circoviren in Bezug auf die Xenotransplantation: in vitro Infektionsstudien an humanen Zelllinien mit dem porzinen Circovirus Typ 1 und Typ 2 und Etablierung einer Konsensusprimer-PCR zur Suche nach neuartigen Circoviren

Abstract

Der Mangel an Spenderorganen in der Allotransplantation hat dazu geführt, dass die Xenotransplantation, also die Transplantation von Schweineorganen auf den Menschen, als alternative Methode verfolgt wird um einen akuten Organmangel beim Menschen zumindest zeitweise zu überbrücken. Jedoch besteht neben immunologischen Abstoßungsreaktionen und der physiologischen Inkompatibilität die Gefahr der Übertragung porciner Viren auf den humanen Rezipienten, wie z.B. durch die porzinen Circoviren. Eine weitere wichtige Frage, die zu klären ist, ist in diesem Zusammenhang die Existenz eines humanen Circovirus, das mit einem porzinen Circovirus rekombinieren könnte. Zur Risikoabschätzung porziner Circoviren in der Xenotransplantation wurde deshalb eine Konsensusprimer-PCR zur Suche nach einem neuartigem Circovirus etabliert und zudem die Suszeptibilität der PCV auf humanen Zellen getestet. Circoviren sind charakterisiert durch ein einzelsträngiges, zirkulär geschlossenes DNA-Genom und nicht-umhüllte Kapside. Die porzinen Circoviren Typ 1 und Typ 2 (PCV1/2) gehören zum Genus Circovirus der Familie Circoviridae. Während PCV1 apathogen ist, ist PCV2 Verursacher der Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS), einer verheerenden Krankheit bei Absetzferkeln. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich eine Konsensusprimer-PCR etabliert um nach einem humanen Circovirus zu suchen; die degenerierten Primer dieser PCR detektierten hoch- konservierte Regionen im rep-Gen aller Circoviren. Mit dieser Methode konnte ein neues Taubencircovirus (PiCV) identifiziert und anschließend charakterisiert werden, während die Untersuchung von 1101 humaner Proben nicht zur Detektion eines neuen humanen Circovirus führte. Weiterhin wurde die PCV Suszeptibilität auf humanen Zellen untersucht durch Transfektion mit religierter Virus-DNA von PCV und Infektion mit Viruspartikeln. Die Infektion mit PCV1 und PCV2 wurde nachgewiesen mit dem indirekten Immunfluoreszenztest und mit PCR. Als Ergebnis konnte festgehalten werden, dass sowohl die Transfektion als auch die Infektion mit PCV in verschiedenen humanen Zellen in einer Expression viraler Proteine resultierte. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass PCV2 Apoptose induziert. Experimente und Ergebnisse zur Analyse der Apoptose-induzierenden Gen-Domain werden in dieser Arbeit präsentiert.

The lack of human donor organs in allotransplantation has led to a proposal for the use of animal organs (e.g. pigs) as alternative therapeutic material for humans. Besides immunological problems like rejection and physiological incompatibility of the transplant, one of the major concerns is the transmission of porcine viruses, e.g. porcine circoviruses (PCV), and the existance of a human circovirus that may recombine with porcine circoviruses resulting in a new virus. To assess the risk of a putative new zoonosis, a consensusprimer-PCR has been established to search for a human circovirus and infection studies with human cell-lines were carried out. Circoviruses are characterised by small single-stranded circular DNA genomes and non-enveloped capsids. Porcine Circovirus type 1 and 2 (PCV1/2) belong to the genus Circovirus of the family Circoviridae. While PCV1 is apathogen, PCV2 is the etiological agent of Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS), a new emerging disease in pigs. In this study I established a consensusprimer-PCR to search for a human circovirus; the degenerate primers used in this PCR amplify highly-conserved regions of the rep-gene of all known circoviruses. With this method a new pigeon circovirus (PiCV) could be identified and characterised, while the investigation of 1101 human samples resulted in no detection of a human circovirus. Furthermore, in this thesis PCV susceptibility of human cell-lines was carried out by transfection with religated virus-DNA of PCV and by infection with virus stocks. Infection with PCV1 and 2 was detected by PCR and indirect immunofluorescence assay. As a result, the transfection and the infection studies both resulted in expression of viral protein in different human cells. In addition, further experiments showed that PCV2 induces apoptosis in human cells. Experiments analysing the role of viral gene products in induction of apoptosis will be presented in this work.