Lokale Applikation von BMP-2-Plasmiden mittels non-viralen Vektors zur Stimulation der Frakturheilung: eine histologische Untersuchung am Rattenmodell

Abstract

Seit vielen Jahren wird versucht, die Frakturheilung mit Hilfe von Wachstumsfaktoren zu beschleunigen und somit Komplikationen zu reduzieren. Gegenwärtig wird BMP-2 als rekombinant humanes Protein im klinischen Einsatz lokal appliziert. Eine andere Applikationsart von Wachstumsfaktoren ist die Gentherapie. Eine Neuentwicklung nicht-viraler Vektoren sind sogenannte COPROGs (Copolymer-protected gene vectors). Polymere umhüllen das zu kodierende Plasmid und bieten unter anderem Schutz vor zu schnellem Abbau in der Zelle. Ziel der Studie war es zu untersuchen, ob die lokale Applikation von BMP-2-Plasmiden in Form von COPROGs die Frakturheilung in einem Rattenmodell stimuliert. Für die vorliegende Studie dienten als Versuchstiere Sprague Dawley Ratten. Die Tiere wurden in 3 Versuchsgruppen eingeteilt, einseitig die Tibia frakturiert und intramedullär mit einem Kirschner- Titandraht stabilisiert. Eine vierte Gruppe diente zum Nachweis der Transfektion. Es fanden zu 2 Zeitpunkten (28. und 42. Tag postoperativ) Untersuchungen statt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die histologischen Ergebnisse analysiert. In anderen Teilen der Studie wurden biomechanische Untersuchungen als auch Untersuchungen zur Transfektion durchgeführt. In allen Teilen der Studie erfolgten radiologische Kontrollen, Kontrollen der Serumparameter, Gewichts- und Temperaturbestimmungen. Die lokale Applikation von BMP-2-Plasmiden zeigte in der histologischen Auswertung keinen signifikanten Vorteil der BMP-2-Gruppe gegenüber den anderen Versuchsgruppen nach 28 bzw. 42 Tagen. Einen Anhalt für eine fortgeschrittenere bzw. beschleunigtere Knochenheilung in der COPROGs+BMP-2 Gruppe ergab sich nicht. Histomorphologisch konnte in allen Gruppen ein ähnlicher Kallusaufbau nachgewiesen werden. Initial zeigte sich ein signifikant geringerer mineralisierter Anteil kortikal und periostal in der BMP-2-Gruppe verglichen zur Kontrollgruppe am 28. Tag. Dieser Unterschied war am 42. Tag nicht mehr nachweisbar. Radiologisch gab es ebenfalls keinen Hinweis auf einen initial schnelleren Heilungsbeginn der mit COPROGs+BMP-2 behandelten Frakturen verglichen zur Kontrollgruppe. Die biomechanischen Untersuchungen zeigten ein signifikant erhöhtes maximales Drehmoment in der BMP-2-Gruppe am 42. postoperativen Tag. Die Transfektionsfähigkeit der COPROGs wurde bestätigt, ohne dabei eine systemische Expression des Reportergens hervorzurufen. Die Transfektionseffizienz non-viraler Vektorsysteme ist bekanntermaßen geringer als die viraler Vektorsysteme. Dies könnte einer der Gründe der nicht eindeutigen Ergebnisse sein. Ein weiterer Grund ist möglicherweise eine zu niedrige BMP-2-Plasmid-Konzentration in der PDLLA- Beschichtung. Allerdings ist die Sicherheit non-viraler Vektoren hervorzuheben, die durch Teile der Studie bestätigt werden konnte. Als eine der ersten in vivo-Studien mit COPROGs ist diese Wegbereiter für weitere Untersuchungen. Für die Zukunft ist zu überlegen, andere Trägermaterialien bzw. Konzentrationen von COPROGs+BMP-2 zu nutzen, um die positiven Ergebnisse der in vitro-Versuche als auch der biomechanischen Untersuchungen mit der Histomorphometrie zu stützen und sichere Behandlungsstrategien für die klinische Anwendung zu entwickeln.

For many years, it has been attempted to accelerate fracture healing by using growth factors to reduce complications. Currently the recombinant human protein BMP-2 is locally applied in clinical use. Another possibility for the application of growth factors is gene therapy. A new type of non-viral gene vectors is called COPROGs. Here, polymers encase the plasmid which is to be encoded, and offer protection from unduly rapid degradation in the cell. The aim of the study was to investigate whether the local application of BMP-2 plasmids in the form of COPROGs in a rat model stimulates fracture healing. For the study at hand, Sprague Dawley rats have been used. The animals were divided into three experimental groups, on one side the tibia was fractured and stabilized with an intramedullary K-titanium wire. Another group was used to detect transfection. Examination took place twice. In the present study, the histological findings were analyzed. Biomechanical testing was also carried out. Radiological controls, controls of the serum parameters, and weight and temperature measurements were tested throughout the experimental period. Local application of BMP-2 plasmids showed no significant advantage of the BMP-2 group compared to the other experimental groups after 28 and 42 days. In the histological examinations, no advanced or accelerated bone healing for COPROGs+BMP-2 treated animals were shown, compared to the control group. The morphology of the callus region did not show any significant differences between the three groups. On day 28 after fracture, a significantly less mineralized area was recorded in the BMP-2 group both cortical and periosteal, compared to the control group. This difference was no longer seen on day 42. Applying radiological parameters, there was no indication of an initial rapid healing of the treated COPROGs and BMP-2 fractures, compared to the control group. The biomechanical studies have shown a significant increase in the maximum load in the BMP-2 group on day 42 after fracture. The transfection ability of COPROGs was confirmed without causing a systemic expression of the reporter gene. The inconclusive results may possibly be caused by an insufficient concentration of BMP-2 plasmid in the PDLLA coating. The transfection efficiency of non-viral vector systems is known to be relatively lower than the viral vector systems. However, the safety of non-viral vectors should be emphasized, as confirmed by this study. As one of the first in vivo studies with COPROGs, this study paves the way for further research. It may then be worth considering the use of other carrier systems or different concentrations of COPROGs and BMP-2, in order to confirm the positive results of the in vitro experiments as well as the biomechanics studies with histomorphometry and to develop safe treatment strategies for clinical application.