Identifizierung von Spurenelementproteinen im gastrointestinalen Trakt der Ratte und Humanzelllinien unter Berücksichtigung des Selen-Mangels

Abstract

Die Wichtigkeit der Spurenelemente in der Ätiologie bei Erkrankungen des Verdauungstraktes ist wahrscheinlich zum einen auf die protektive Wirkung der Spurenelementproteine gegen die Schädigung der Zellen durch aggressive Peroxide und zum anderen auf Kettenreaktionen von Missfunktionen unkorrekt exprimierter Proteine zurück zu führen. Untersuchungen an Zelllinien, die mit den jeweiligen Spurenelementen Se, Cu, Mn oder Zn inkubiert wurden, zeigten, dass dabei einige Proteine exprimiert werden, die ihre biologische Aktivität erst entfalten können, wenn sie derartige Elemente binden. Berichtet wurde von anderen Autoren auch, dass Metallo-/Metalloidproteine im Stoffwechsel der Gewebe des Verdauungstraktes involviert sind. Die durchgeführten Experimente und die daraus gewonnenen Ergebnisse dieser Arbeit sind dem Verdauungstrakt, einem System dessen Wichtigkeit für die Aufrechterhaltung eines gesunden Organismus von sehr großer Bedeutung ist, gewidmet. Neben analytischen, biochemischen und zellbiologischen Methoden wurden Verfahren der Immunchemie angewendet. Mit Hilfe der analytischen Methoden INAA, ICP-MS und AAS wurden die Gehalte der Spurenelemente As, Cd, Co, Cr, Cs, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, Rb, Se, Ti, V und Zn in Geweben des Verdauungstraktes von Laborratten unter Berücksichtigung des Selenstatus der Versuchstiere untersucht. Ein schwach signifikanter Unterschied durch den Se-Einfluss war für den Gesamtgehalt an Fe festzustellen. Für die anderen untersuchten Elemente konnte kein Einfluss des Se beobachtet werden. Festgestellt wurde aber, dass jede der drei verwendeten Methoden nur für bestimmte Elemente geeignet ist. Die ICP-MS ist als eine Multielementbestimmungsmethode hervorragend in der Lage, in kurzer Zeit Ergebnisse zu liefern, und sollte deswegen als erstes angewendet werden, sofern ausreichend Probenmaterial zur Verfügung steht. Bei geringen Probenmengen, wie den subzellulären Kompartimenten, ist INAA der ICP-MS für quantitative Bestimmungen vorzuziehen. Mit Hilfe der INAA konnte die Verteilung sowie die Gesamtkonzentration der Spurenelemente Co, Cr, Cs, Fe, Mn, Rb, Se und Zn in den Zellorganellen (Kerne, Mitochondrien, Mikrosomen und Zytosol) der Organe des Verdauungstrakts bestimmt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Fe-Gehalte signifikante Unterschiede in den Mikrosomen des Magens von Se(-)- und Se(+)-Tieren aufweisen. Durch die Kopplung von Laserablation mit ICP-MS war die qualitative Bestimmung über die Verteilung der Elemente As, Cd, Cu, Mo, Ni, und V in den subzellulären Fraktionen auch bei extrem geringen Mengen erfolgreich. Aus den Geweben des gastrointestinalen Trakts der Ratte mit unterschiedlichem Selenstatus sowie der humanen Karzenomdickdarmzelllinie HT29 gewonnenen Zytosole wurden durch Onlinekopplung der Größenausschlusschromatographie (SEC) mit der induktiv gekoppelten Plasma- Massenspektrometrie zuerst die Proteine in den Zytosolen mit Hilfe der SEC fraktioniert und anschließend die in den Proteinen enthaltenen Elemente mittels Massenspektrometrie bestimmt. Die erhaltenen chromatographischen Profile von As, Cd, Co, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Ti, V und Zn weisen darauf hin, dass diese Elemente proteingebunden vorliegen. Für Rb und Cs gilt das nicht. Dieses Resultat legt den Verdacht nahe, dass diese Elemente auch Bestandteile bisher nicht identifizierter Proteine sind. Bei der Detektion spurenelementhaltiger Proteine mittels SEC-ICP-MS wurde unter anderem das Element Molybdän im Dickdarm-Zytosol in zwei verschiedenen Molekularmassen (ca. 50 und 7 kDa) identifiziert, während im Zytosol der humanen Karzenomdickdarmzelllinie HT29 nur die 7 kDa Fraktion zu identifizieren war. Aufgrund dieses Ergebnisses wurde die Zelllinie HT29 mit Mo inkubiert um festzustellen, ob Mo auch in Proteinen mit höheren Molekularmassen dieser Zellen bindet. Parallel zu diesen Untersuchungen wurde die Leber als Vergleichsgewebe herangezogen. Durch Fraktionierung der Leberzellen wurde das Zytosol gewonnen. Mittels SEC wurden die gesammelten Fraktionen durch AAS- Analyse auf Mo untersucht. In den Proteinen des Leber-Zytosols fanden sich neben der 50 kDa Proteinfraktion auch die molybdänhaltige 7 kDa- Proteinfraktion. Die Analyse durch LC/ESI-MS/MS ergab ein bislang uncharakterisiertes Protein (Primärstruktur von LOC500475 wurde theoretisch berechnet). Die Identifizierung von Selenoproteinen erfolgte durch in vivo Markierung der Ratten von unterschiedlichem Selenstatus mit 75Se nach der Trennung der Proteine mittels SDS-PAGE und anschließender Autoradiographie der Homogenate. Dabei wurden in den Homogenaten der Se(-)-Tiere im Molekularmassenbereich zwischen 10 kDa und 70 kDa Selenoproteine gefunden. Diese Selenoproteine konnten mit Hilfe der 2D-Elektrophorese bestätigt und durch eine sehr gute Aufspreizung der Proteinbanden mit IP-Werten zwischen 3,5 und 9,0 und Molekularmassen zwischen 10 kDa und 80 kDa eindeutig detektiert werden. Das für die Analyse der Proteinexpression geeignete Computerprogramm Melanie 6.0 lieferte für die Homogenate der Zunge von Se(+)- und Se(-)-Tieren 35 Proteinexpressionsunterschiede. 9 dieser Proteinspots im Se(+)-Homogenat waren signifikant stärker exprimiert als im Se(-)-Homogenat. In den Homogenaten des Magens waren 20 Unterschiede detektierbar. Von diesen Proteinspots waren 12 stärker im Se(+)-Homogenat exprimiert. Die Analyse der Dünndarm-Homogenate ergab 22 unterschiedliche Expressionen, wobei 12 davon in den Se(+)-Homogenaten wesentlich stärker exprimiert waren. In den Dickdarm- Homogenaten der beiden Populationen konnten 13 Ungleichheiten beobachtet werden. Davon waren sechs in den Homogenaten der Se(+)-Tiere signifikant stärker exprimiert. Die Identifizierung der Proteinspots 1-3 im Homogenat der Zunge von selenadäquat ernährten Tieren mittels tryptischer Spaltung sowie die Bestimmung der Massen einiger Peptide durch die Massenspektrometrie (MALDI-MS) erfolgte durch den Vergleich mit den theoretischen Daten der Peptide/Proteine. Identifiziert wurden die Proteine UDP-Glucose-6 dehydrogenase (1), Hydroxyl- Coenzym A dehydrogenase (2) und Ubiquitin C-terminale Hydrolase Isozym L3 (3). Im Magen-Homogenat der Se(+)- und Se(-)-Tiere konnten die Proteine Actin-2, Prohibitin, Zytokeratin 8 sowie das bisher nur in silico bekannte Protein FLJ20729 (Spot 1-4) identifiziert werden. Die Detektion von metallhaltigen Proteinen sowie Selenoproteinen in den Homogenaten des Gastrointestinaltraktes erfolgte durch immunochemische Untersuchungen. Die verwendeten Antikörper, gerichtet gegen bestimmte Proteine, zeigten positive Signale für die Proteine SOD, LOX, MT-I und MT-II, plasma GPx (GPx3), das saure 15 kDa-Selenoprotein sowie für das neu entdeckte Cu-haltige Protein Dermatopontin (DPT), und wurden, mit Ausnahme der SOD für den Darmtrakt, erstmalig mittels immunochemischer Detektion in dieser Arbeit nachgewiesen.

The importance of the trace elements in the etiology of gastro-intestinal diseases is likely to lead back to two reasons: Firstly to the protective effecting of the trace element containing proteins against the damage of cells by aggressive peroxides. Secondly to a rank of chain reactions with dysfunction of uncorrected expressed proteins. Investigations of cell lines which were incubated with the elements Cu, Mn, Se, Mo, and Zn have shown that some proteins were expressed, which are able to unfold their biological activity if they bind such elements. Additionally, it was also reported by other authors that metalloproteins and metalloid containing proteins are involved in the metabolisms of the tissues of the digestion tract. The experiments carried out in this thesis and the results obtained are devoted to the digestion tract, a system whose correct function is indispensable for the organism. For the realisation of the experiments concerning the thesis analytical, biochemical, molecular and immunochemical procedures were applied. By means of the INAA, ICP-MS, and AAS the contents of the trace elements As, Cd, Co, Cr, Cs, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, Rb, Se, Ti, V, and Zn in rat tissues of the digestive tract were examined. A low significant value was observed regarding the total content of Fe by the influence of Se. For other elements a significant effect could not be observed. As a result, after the application of the different analytical methods it could be said that each method is suitable only for some elements. Nevertheless, the ICP-MS should be used at first, because the measurements can be carried out quickly and the results are obtainable very fast. In the case of very low amounts of the samples it is better to take the measurements by means of the INNA for quantitative analysis. By means of the INAA, the concentration and the distribution of the trace elements As, Co, Cr, Fe, Mn, Rb, Se and Zn were determined in the cell organelles (nuclei, mitichondria, microsoms and cytosol) of several tissues of the intestinal tract. It was proved that the Fe concentration showed significant differences in the microsomes of the tongue and stomach of the Se(-) und Se(+) animals. By the coupling of the laser ablation with the ICP- MS, the qualitative determination concerning the distribution of the elements As, Cd, Cu, Mo, Ni, and V in the subcellular fractions, also with extremely little contents, was very successful. The proteins in the cytosols, which were obtained of the tissues of the rats fed with different selenium concentrations as well as of the human colon cell-lines HT29, were determined at first in the cytosols by the online-coupling of the size exclusion chromatography (SEC) with the inductively coupling plasma-massenspectrometry. Afterwards, the elements inside the proteins were determined by mass spectrometry. The obtained chromatographic profiles of As, Cd, Co, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Ti, V, and Zn indicate that the elements above are binding to proteins. This could not be found for Rb and Cs. By means of these results it is assumed that these elements are part of proteins which are still unknown. By the detection of trace elements containing proteins by means of SEC-ICP-MS it was found that the element Mo was bound to the proteins with the molecular mass of 7 kDa and 50 kDa, whereas in the cytosol of the human colon cell-lines the Mo was bound only to the protein with the molecular mass of 7 kDa. As a result of this outcome the cell-line HT29 was incubated with Mo to find out if the element also binds to proteins with higher molecular masses than 7 kDa. Parallel to this investigation, experiments were carried out with the liver cytosol. The liver cells were fractionated. The proteins in the obtained cytosol were separated by SEC. The resulted protein fractions were analysed with regard to Mo by means of the AAS. In the proteins of the liver cytosol besides the 50 kDa-protein a further Mo containing protein with the molecular mass of 7 kDa was identified. Based of the obtained result the cell lines HT 29 was incubated with Mo to find out if Mo is able to bind to proteins with higher molecular masses. Parallel to this study the organ liver was used as a comparison tissue. By fractionation of the liver cells the cytosol was separated by means of SEC of the total fraction presence of Mo was checked by AAS analysis. In the protein mixture of the liver cytosol it could be detected the Mo-containing protein with the molecular mass of 7 kDa and besides of them the other Mo-containing protein with the molecular mass of 50 kDa was also detected. The analysis of the 7 kda protien by LC/ESI-MS/MS resulted the still unknown protein LOC500475. The primary structure of this protein is predicted only by theoretical calculation of the amino acids. The identification of the selenoproteins in the homogenates of the gastrointestinal-tract was done by labelling the rats with 75Se in vivo, separating the proteins by SDS-PAGE, and determining the selenium in the proteins by autoradiography. Thereby, labelled proteins in the homogenate of the (Se-)-rats were detected in the molecular mass range between 10 kDa and 70 kDa. These proteins were also found using the 2D-electrophoresis distributed in the pI-range between 3.5 and 9.0 and molecular masses between 10 kDa and 80 kDa. For the analysis of the expressed proteins the appropriate computer program Melanie 6.0 provided 35 differences of the expressed proteins in the tongue homogenates of the (Se+)- and (Se-)-rats. 9 of these proteins were expressed significantly higher in the Se(+)-homogenate than in the Se(-)-homogenate. In the homogenate of the stomach 20 differences were found. 12 of these proteinspots were expressed higher in the Se (+)-homogenate. The analysis of the small intestine provided 22 differences of the expressed proteins. 12 of them were expressed higher in the Se (+)-homogenate. In the colon homogenate of the (Se+) and (Se-)- rats 13 differences were observed. 6 of these protein spots were expressed stronger significant in the Se (+)-homogenate. The identification of the protein spots 1–3 in the (Se+)-homogenate of the tongue was reached by the MALDI-MS after tryptic digestion of the proteins and comparison of the obtained peptide masses with the theoretical data for peptide masses. Identified were the proteins UDP-Glucose-6 dehydrogenase (1), Hydroxyl-Coenzym A dehydrogenase (2), and Ubiquitin C-terminale hydrolase isozym L3 (3). Each of these proteins is involved in the metabolic processes of the gastro intestinal tract. In the stomach homogenate of the Se(+)- und Se(-)-rats the proteins Actin-2, Prohibitin, cytokeratin 8 as well as the protein FLJ20729 (Spot 1-4) were identified. The latter is up to now only known by in silico investigations. The detection of the metalloproteins as well as of the selenoproteins in the homogenate of the digestion tract was reached by the application of several immunochemical tests. The used antibodies provided positive signals for the proteins SOD, LOX, MT-I and MT-II, plasma GPx (GPx3), and for the acid 15 kDa- Selenoprotein as well as the new discovered Cu-containing protein DPT. In this thesis with exception of SOD these proteins had been shown to be expressed in the gastro intestinal tract at the first time by means of immunochemical methods.