Kinase activity reporters for eukaryotic signaling pathway study: Multiplexed profiling of cellular kinase activities by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Abstract

Protein kinases play a major role in regulating biological processes via integrated signaling networks. The cellular outcomes of such activities, including metaphase entry in cell cycle progression for example, are the result of multiple kinase and phosphatase actions. Therefore, multiplexed profiling of cellular kinase activities is of utmost importance to understand the functional correlations of these enzymes in complex signaling networks. In addition, such multiplexed kinase activity assays are essential to investigate the modes of action and specificities of kinase inhibitors, which constitute important drug targets in cancer therapy. To date, most assays fail to simultaneously quantify multiple kinase activities in parallel. Thus, new methods are needed to overcome these limitations. High-resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy has emerged as a powerful biophysical tool suited for the qualitative and quantitative analysis of protein phosphorylation. Since each protein residue gives rise to a characteristic NMR signal, multiple phosphorylation reactions on different residues of the same substrate protein or on different proteins can be followed simultaneously by observing the respective NMR signals of each of modified amino acid residues. NMR is non-invasive and non-disruptive, which enables direct observations of multiple phosphorylation reactions in real-time, as they proceed inside the NMR sample tube. Therefore, NMR can directly be used to simultaneously determine multiple kinase activities in integrated signaling networks. This thesis presents a combination of time-resolved, high-resolution NMR spectroscopy with newly developed peptide-based kinase activity reporters (KARs) for multiplexed, cellular kinase activity measurements in complex environments such as cell lysates. To develop this method, I chose a well- studied model system, cytostatic factor (CSF)-arrested Xenopus laevis egg extracts, which contain many well-characterized, endogenous kinase activities. Central to this method is the design of 15N isotope-labeled kinase activity reporters (KARs) that correspond to optimized consensus motif peptides with the highest possible phosphorylation efficiencies and substrate specificities, while exhibiting lowest degrees of cross-reactivity with off-target kinases. Using these KARs, I simultaneously quantified the activities of 8 different, cell cycle regulated serine/threonine kinases in Xenopus CSF extracts in a single NMR experiment. Furthermore, I demonstrate that KARs can additionally be used to profile cellular phosphatase activities by a simple expansion of the KAR concept that entails turning KARs into phosphatase activity reporters (pKARs, i.e. pre-phosphorylated KARs). Both tools are well suited to investigate cellular signaling events that rely on the balanced action of kinases and phosphatases. Finally, NMR and KARs were employed to examine kinase inhibitor efficiencies and specificities under cellular conditions. Overall, both methods have great potential for multiplexed-profiling approaches of cellular kinase and phosphatase activities and can be expanded to include larger number of enzymes to be assessed in parallel, as well as be applied to more complex cellular systems such as human cell lysates, or intact cells. I anticipate that both methods may become particularly useful in providing quantitative information about pathological signaling behaviors as are observed in multivariate etiology diseases such as cancer, as well as to provide novel routes for drug screening approaches.

Protein Kinasen steuern biologische Signaltransduktionsprozesse in einer integrativen Art und Weise, während zelluläre Antworten auf solche Signaltransduktionsprozesse wichtige Schritte des Zellzyklus wie zum Beispiel die Übergänge in einzelne Zellzyklusstadien regulieren. Um die Aktivitäten einzelner Kinasen in diesen Prozessen verstehen zu lernen ist es wichtig die funktionellen Abhänigkeiten untereinander zu studieren. Dafür sind neue Methoden der integrativen Kinasen Analyse notwendig. Gleichzeitig, erlauben uns solche neuartigen, quantitativen Methoden auch die Wirkungsweise von Kinasen Inhibitoren zu studieren, welche vor allem in der Krebstherapie eine wichtige pharmakologische Rolle spielen. Hierbei ist es vor allem wichtig neue Herangehensweisen zur parallelen Charakterisierung mehrer Kinasen Aktivitäten zu entwickeln. In diesem Hinblick hat sich die hochauflösende Kernresonanz (NMR) Spektroskopie als hervorragend geeignetes, analytisches Instrument bestätigt. Einzelne Aminosäurereste von Proteinen haben charakteristische Kernresonanzfrequenzen und sobald Proteinreste von Kinasen in phosphorylierte Zustände überführt werden, führt dies zu spezifischen Veränderungen ihrer Resonanzfrequenzen, welche mittels der NMR Spektroskopie leicht auszulesen sind. Ziel der Doktorarbeit war es neue Wege zur Charakterisierung von zellulaeren Kinase Aktivitäten zu erschließen. Im speziellen wurde darauf hingearbeitet auf Peptiden basierende Kinasen Reporter herzustellen die es uns erlauben würden mehrere dieser enzymatischen Aktivitäten gleichzeitig mittels NMR Spektroskopie direkt in der zellulären Umgebungen auszulesen. Im Zuge dieser Doktorarbeit ist es mir gelungen diese Idee umzusetzen und solche neuartigen Instrumente herzustellen. Diese fanden direkte Anwendungen in einem zellulären Modelsystem, den so genannten cytostatic-factor arrested (CSF) Xenopus laevis Ei Extrakten. Mittels zeitaufgelöster NMR Spektroskopie ist es mir gelungen in diesen Extrakten 8 Kinase Aktivitäten gleichzeitig, quantitativ und in einem einzigen NMR Experiment zu bestimmen. Des Weiteren wurden Anwendungen zur Charakterisierung von Kinase Inhibitoren erfolgreich umgesetzt. Grundsätzlich ergibt sich durch diese neue Methodik eine Vielzahl an Anwendungen, vor allem in der Charakterisierung zellulärer Kinase Aktivitäten, aber auch in der Entwicklung neuartiger Wirkstoffe in der Krebstherapie.