Mechanismen der NF-κB-Aktivierung durch genotoxischen Stress

Abstract

Bei der zellulären DNA-Schadensantwort führt die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB zur Induktion anti-apoptotischer Gene. Es wird angenommen, dass dieses Überlebensprogramm im Zusammenspiel mit Zellzyklus- Regulation und DNA-Reparaturvorgängen dafür sorgt, dass im Fall mäßiger DNA- Schädigung der zelluläre Lebenszyklus wieder aufgenommen werden kann. Im Rahmen der vorgelegten Dissertation wurde ein komplexes Signalnetzwerk aufgedeckt, das der NF-κB-Aktivierung durch DNA-Strangbrüche zugrunde liegt. Die zentralen Mediatoren zellulärer DNA-Schadensreaktionen PARP-1 und ATM induzieren zwei Signalachsen, die auf der Ebene der IKK-Aktivierung im Zytoplasma konvergieren. Nach Rekrutierung an DNA-Strangbrüche wird PARP-1 automodifiziert und ins Nukleoplasma freigesetzt. Daraufhin bildet das PARylierte Enzym einen transienten Komplex mit IKKγ, PIASy und ATM, wobei Protein-PAR-Wechselwirkungen eine stabilisierende Funktion wahrnehmen. Anschließend wird IKKγ durch PIASy mit SUMO1 modifiziert. Dieser Signalschritt ist für die Aktivierung des IKK-NF-κB-Systems erforderlich. Simultan wird ATM Ca2+-abhängig aus dem Zellkern exportiert und induziert nach Assoziation mit der Plasmamembran eine zweite Signalachse. Diese besteht aus einer Kette von Prozessen, die Ähnlichkeiten zu einigen klassischen NF-κB-Signalwegen, wie dem IL-1/Toll-Weg, aufweist. ATM bewirkt eine Aktivierung der Ubiquitin-Ligase TRAF6, die in Kooperation mit dem E2-Enzymkomplex Ubc13/Uev1A Lys63-verknüpfte Polyubiquitin-Ketten an sich selbst und eventuell an noch nicht identifizierten Signalkomponenten konjugiert. Nach der gegenwärtigen Vorstellung werden TAK1- und IKK-Komplexe an diese nicht-degradativen Ubiquitin-Polymere rekrutiert und in räumliche Nähe zu einander gebracht. Daraufhin kommt es zu einer trans-Autophosphorylierung und Aktivierung der Kinase TAK1, die für die Phosphorylierung und Aktivierung von IKKβ verantwortlich ist. IKKγ wird nach der Rekrutierung des IKK-Komplexes an Lys63-polyubiquitinierte Strukturen mono- und diubiquitiniert. Neben IKKβ- Phosphorylierung und IKKγ-Sumoylierung stellt diese Modifikation eine weitere Voraussetzung für die Aktivierung des IKK-Komplexes durch genotoxischen Stress dar. Da auch PARP-1 und PIASy neben ATM für Mono-/Diubiquitinierung von IKKγ erforderlich sind, stellt diese IKKγ-Modifikation den Konvergenzpunkt des ATM- und des PARP-1-ausgelösten Signalmoduls dar. Die präsentierten Ergebnisse ergeben ein neues Konzept der NF-κB-Aktivierung durch genotoxischen Stress. Neben der Identifikation neuer Schlüsselfaktoren des Signalwegs (PARP-1, TRAF6, TAB2, TAK1) konnten grundlegende Regulationsmechanismen dieser Kern- Zytoplasma-Signalkaskade aufgedeckt werden. Charakteristisch ist die Synthese von gerüstbildenden Polymeren (PAR und Lys63-Ubiquitin-Polymeren), an denen Multiproteinkomplexe assembliert werden (PARP-Signalosom und TAK1-IKK- Signalosom). In diesen supramolekularen Strukturen wird der Signalfluss integriert und an Enzyme weitergeleitet, die post-translationale Modifikationen an IKK-Untereinheiten vornehmen (IKKγ-Sumoylierung, IKKγ- Ubiquitinierung, IKKβ-Phosphorylierung). Diese Modifikationen beeinflussen sich zum Teil gegenseitig und tragen gemeinsam zur Aktivierung des IKK- Komplexes durch genotoxischen Stress bei.

Activated as part of the cellular response to DNA-damage, the transcription factor NF-κB regulates the expression of anti-apoptotic genes. Thus, in case of moderate genotoxic stress, this survival program, in cooperation with cell cycle regulation and DNA repair, facilitates the resumption of cellular life cycle. The present thesis reveals a complex signaling network leading to NF-κB activation by DNA strand breaks. PARP-1 and ATM, as the central mediators of cellular responses to DNA damage, induce two signaling cascades, which converge on the activation of the IKK complex in the cytoplasm. Upon recruitment to DNA strand breaks, automodified PARP-1 is released into the nucleoplasm and forms a transient complex with IKKγ, PIASy and ATM. This signalosome is stabilized by protein-PAR-interactions and promotes PIASy mediated sumoylation of IKKγ, a modification necessary for the activation of the IKK-NF-κB system by genotoxic stress. Simultaneously, ATM is exported out of the nucleus in a Ca2+-dependent manner and induces the second identified signaling cascade at the plasma membrane. This pathway exhibits some characteristics of the classical NF-κB activation cascades, e.g. IL-1/Toll receptor signaling. ATM activates the ubiquitin ligase TRAF6, which functions in concert with the E2 enzyme complex Ubc13/Uev1A and conjugates Lys63-linked poly-ubiquitin chains to itself and possibly to still unidentified signaling factors. According to the current model, non-degradative ubiquitin polymers recruit TAK1 and IKK complexes, thereby bringing them into close proximity. Subsequently, TAK1 kinase is activated by trans-autophosphorylation, leading to phosphorylation and activation of IKKβ. Upon recruitment to Lys63-polyubiquitinated structures, IKKγ becomes mono- and diubiquitinated. Along with IKKβ phosphorylation and IKKγ sumoylation, this modification is prerequisite for the activation of the IKK complex by genotoxic stress. As in addition to ATM, PARP-1 and PIASy are also required for mono/diubiquitination of IKKγ, the ATM and the PARP-1 triggered signaling modules converge at the level of this IKKγ modification. The present work establishes a new concept of NF-κB activation by genotoxic stress. In addition to the identification of new key regulators (PARP-1, TRAF6, TAB2, TAK1) fundamental regulatory mechanisms of this nuclear-to-cytoplasmic signaling network could be uncovered. One hallmark is the synthesis of polymers with scaffolding function (PAR and Lys63-ubiquitin polymers), which facilitate the assembly of multiprotein complexes (PARP signalosome and TAK1-IKK signalosom, respectively). Within these supramolecular structures, the signaling information is integrated and transduced to enzymes, which post-translationally modify IKK subunits (IKKγ sumoylation, IKKγ ubiquitination and IKKβ phosphorylation). These modifications are in part interdependent and contribute cooperatively to the activation of the IKK complex by genotoxic stress.