Charakterisierung molekularer und elektrophysiologischer Effekte von Protamin an Nierenepithelzellen

Abstract

Das polykationische Protein Protamin führt an sogenannten lecken Epithelien - beispielsweise im proximalen Tubulus der Niere - zu einer Erhöhung des transepithelialen Widerstandes. Dieser Effekt wurde am Zellkulturmodell von MDCK-Zellen untersucht. Elektrophysiologische Messungen erfolgten in der Ussingkammer unter Anwendung unterschiedlicher Zellklonen, Temperaturvariation und Einsatz verschiedener Inhibitoren. Ferner wurde die Membran- und Tight Junction-Struktur mithilfe von Western Blots und Immunfluoreszenz untersucht. Es zeigte sich, dass die Widerstandszunahme auf die größenunselektive Abnahme der Leitfähigkeit für monovalente Kationen (Na+, K+, Li+, Rb+, Cs+) zurückzuführen war, wogegen die Leitfähigkeit für Chlorid unverändert blieb. Unter Einsatz claudintransfizierter hochohmiger MDCK C7-Zellen zeigte sich, dass der Protamineffekt vom Vorhandensein solcher Claudine abhängig ist, die parazelluläre Kanäle für monovalente Kationen bilden (Claudin-2 und –10b). Eine Transfektion mit Claudin-16 und Claudin-10a zeigte kein von den Vektorkontrollen signifikant unterschiedliches Ergebnis. Weiterhin zeigte sich, dass der Protamineffekt auch bei 4 °C nachweisbar ist, was für eine Unabhängigkeit von energieverbrauchenden intrazellulären Prozessen spricht. Auch ließ sich der Effekt nicht durch die untersuchten Inhibitoren Ly294004, BAPTA-AM, H-8, ML-7, L-NAME, UO126 und SB212090 hemmen. Die Membranzusammensetzung bezüglich Claudin-1, -2, -3, -4, -8, Occludin und E-Cadherin veränderte sich in dem innerhalb des Zeitraums der Widerstandszunahme nicht, jedoch zeigte sich in der Immunfluoreszenz ein stark reduziertes Claudin-2-Signal unter Protamin in der Tight Junction. Die Ergebnisse sprechen dafür, dass die Widerstandszunahme an lecken Epithelien ausgelöst durch Protamin auf einer direkten Interaktion von Protamin mit den kationenkanalbildenden Claudinen 2 und 10b beruht und Protamin möglicherweise einen Blocker dieser extrazellulären Kanäle darstellt.

The polycationic protein protamine leads to an increase in transepithelial resistance in so called leaky epithelia as present in the proximal renal tubule. This effect was further investigated by using a cell-culture-model of MDCK cells. Electrophysiologic effects were studied by using the Ussing- chamber, whereas the membrane- and - more specifically - the tight junction- structure were studied by using the technique of Western blotting and immunofluorescence. It could be shown that the increase in transepithelial resistance was due to a decrease in conductance for monovalent cations (Na+, K+, Li+, Rb+, Cs+), whereas the conductance for chloride did not change. Furthermore, by studying claudin-transfected cell-clones the protamine-effect was shown to be dependent on the expression of claudins that form paracellular cation-channels, claudin-2 and –10b, whereas the overexpression of claudin-10a or –16 did not alter the effect. Additionally, the effect of protamine was not inhibited by lowering the temperature, indicating that intracellular energy- consuming processes may not be responsible for the observed effect. Also the inhibitors Ly294004, BAPTA-AM, H-8, ML-7, L-NAME, UO126 and SB212090 did not have a significant influence. The composition of the tight junction-protein claudin-1, -2, -3, -4, -8, occludin and E-Cadherin was not changed by protamine, although there was a reduction of the claudin-2-signal within the tight junction as shown by means of immunofluorscence. The results indicate that protamine directly interacts with the cation-channel forming cluadins 2 and 10b and possibly acts as a blocker of these extracellular pores.