Highly pathogenic H5N1 avian influenza virus epidemic in Egypt: Detection and protection studies

Abstract

Poultry is the major source of animal protein in under-resourced countries. Introduction of highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV) of subtype H5N1 into such countries had a severe negative impact on the poultry industry and posed a serious threat to public health. Vaccination of poultry was used successfully to reduce the socioeconomic losses during the first wave of the disease in Egypt. However, vaccines as a sole tool to eradicate the HPAIV H5N1 are insufficient to delineate circulation of the virus in vaccinated birds, on the contrary replication of the virulent virus in presence of antibodies induced by the vaccine lead to increase in the mutation rate in genes, such as the hemagglutinin (HA). This is also had negative effects on the sensitivity of molecular diagnostic tools aiming at the HA gene. Second, passive transfer of maternal immunity through eggs to the newly hatched chicks could interfere with their vaccination in the early stage of life. In this study, to match the divergent Egyptian HPAI H5N1 viruses, we adapted primers and probes of the internationally recommended RT-qPCR assay targeting the H5 gene. As a result the sensitivity to detect the Egyptian variant and classical strains was dramatically increased. Furthermore, phylogenetic analyses of the H5 gene of the Egyptian viruses indicated that two major groups of H5N1 viruses are currently co-circulating in poultry in Egypt. We developed a versatile multiplex real time RT-PCR assay to detect all Egyptian HPAI H5N1 viruses and differentiate between the classic 2.2.1 group (isolated mainly from backyard birds and humans) and the genetic variant 2.2.1 group (isolated mainly from commercial vaccinated chickens). Furthermore, we showed that multiple dose vaccination of broiler breeder chickens with an inactivated H5N2 vaccine induced broad humoral immune responses against different antigens; yet, sufficient clinical protection against the newly emerging variant Egyptian HPAIV H5N1 was not induced. Moreover, we demonstrate that the virus is disseminated in and on eggs of infected vaccinated birds after challenge. H5N2 maternal derived immunity didn’t protect chicks challenged with the Egyptian variant HPAI H5N1 virus and interfered with vaccination of 3 days old chicks with homologous H5N2 vaccine. However, vaccine seeded with the recent Egyptian variant H5N1 strain was more highly effective. In countries with endemic status of HPAIV H5N1 in poultry, regular optimization and development of sensitive molecular diagnostics is a real challenge to ensure early detection and control of infected birds. Vaccination of poultry could be a part of a comprehensive control plan but biosecurity measures should be enforced rigorously. The vaccines should be re-evaluated according to their antigenic match with circulating field viruses. Eggs obtained from infected flocks should be considered as a risk factor for silent virus transmission. Maternal immunity could reduce the vaccine efficacy and should be considered when formulating vaccination regimes against HPAIV H5N1.

Geflügel ist die wichtigste Quelle für tierische Proteine in Entwicklungsländern. Das Auftreten von HPAIV H5N1 in diesen Ländern hat schwerwiegende negative Auswirkungen auf deren Geflügelwirtschaft und stellt eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Zur Eindämmung ökonomischer Verluste wurde in Ägypten die gesamte Geflügelpopulation während der ersten Infektionswelle geimpft. Allerdings sind Impfstoffe als einziges Mittel zur HPAIV H5N1 Bekämpfung unzureichend, um die Zirkulation des Virus in geimpften Beständen vollständig zu unterbinden. Darüber hinaus führt das Vorhandensein von Antikörpern zu einem Selektionsdruck auf das Zielprotein, insbesondere das Hämagglutinin (HA), was eine erhöhte Mutationsrate des HA Gens verursacht. Dies führt zur Verminderung der Sensitivität der zur Zeit verwendeten molekulargenetischen Nachweismethoden. Des Weiteren verhindert die Impfung von Elterntieren durch die Übertragung der maternalen Antikörper auf die Nachkommen eine erfolgreiche Impfung der Nachkommen in den ersten Lebenstagen. In dieser Studie wurden Primer und Sonde der international empfohlenen RT-qPCR für das H5-Gen den Sequenzen der stark divergierenden ägyptischen HPAI H5N1-Viren angepaßt. Dies führte zu einer dramatisch verbesserten Sensitivität in der Detektion ägyptischer H5N1 Stämme. Phylogenetische Analysen des H5-Gens der ägyptischen Viren zeigten, dass zwei großen Gruppen divergenter H5N1-Viren derzeit bei Geflügel in Ägypten zirkulieren. Deswegen wurde ein RT-qPCR Multiplex-Assay entwickelt, der alle ägyptischen HPAI H5N1 Viren detektiert und gleichzeitig zwischen der klassischen 2.2.1 Gruppe (isoliert hauptsächlich aus Kleinsthaltungen von Geflügel sowie von Menschen) und der genetischen Variante 2.2.1 (isoliert aus kommerziellen geimpften Hühnern) differenziert. Ferner wurde gezeigt, dass wiederholte Impfungen von Masthähnchen-Elterntieren mit einem inaktivierten H5N2-Impfstoff eine breite humorale Immunantworte gegen unterschiedliche H5 Antigene induzierte. Allerdings konnte hierdurch kein klinischer Schutz gegen die neu entstandene Variante ägyptischer HPAI H5N1 Viren induziert werden. Zudem wurde festgestellt, dass das Virus in und auf Eiern, die von geimpften, infizierten Vögeln gelegt wurden, verbreitet wird. Maternale Immunität infolge einer H5N2 Impfung der Elterntiere vermittelte den Küken keinen Schutz gegen die ägyptische Variante des HPAI H5N1 Virus. Dagegen beeinträchtigte diese maternale Immunität den Erfolg der Impfung von 3 Tage alten Küken mit homologem H5N2-Impfstoff. Eine Impfung mit der aktuellen H5N1 Variante war dagegen effektiver. In Ländern, in denen HPAI H5N1 bei Geflügel endemisch ist, ist eine regelmäßige Optimierung und Fortentwicklung sensitiver molekularbiologischer Testmethoden schwierig, aber für die Früherkennung und Kontrolle infizierter Vögel unabdingbar erforderlich. Die Impfung der Geflügelbestände kann Teil eines umfassenden Kontrollplanes sein, jedoch müssen flankierende Biosicherheitsmaßnahmen rigoros durchgesetzt werden. Die Impfstoffe sollten entsprechend der Antigenprofile der aktuell zirkulierenden Feldviren neu bewertet werden. Eier aus infizierten Herden sind ein Risikofaktor für eine stumme Übertragung des Virus. Maternale Immunität kann die Wirksamkeit von Impfstoffen in sehr jungen Küken negativ beeinflussen.