dc.contributor.author
Stricker, Sigmar
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:38:43Z
dc.date.available
2010-11-04T10:30:15.065Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/12248
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-16446
dc.description.abstract
Angeborene skeletale Fehlbildungen treten beim Menschen häufig auf,
Fehlbildungen des Extremitätenskeletts betreffen im Durchschnitt etwa eine(n)
unter 1000 Neugeborenen. Diese Fehlbildungen manifestieren sich während der
Embryonal- bzw. Fötalphase, sind also Entwicklungsdefekte. Wir haben in den
vergangenen Jahren verschiedene Formen der Extremitätenfehlbildungen
untersucht. Wir konnten für zwei Syndrome, das Al-Awadi/Raas-
Rothschild/Schinzel Phocomelia Syndrom und das Fuhrmann Syndrom die genetische
Ursache herausfinden. Beide Syndrome werden durch Missense Mutationen im
Signalmolekül WNT7A hervorgerufen. Wir konnten in funktionellen Untersuchungen
zeigen, daß die Mutation im Al-Awadi/Raas-Rothschild/Schinzel Phocomelia
Syndrom, das einen sehr schweren Phänotyp zeigt, zu einem totalen
Funktionsverlust von WNT7A führt, während die Mutation im phänotypisch weniger
schweren Fuhrmann Syndrom einen partiellen Funktionsverlust von WNT7A bewirkt.
Dies ist erst die zweite Mutation, die in einem WNT Gen als Ursache für ein
humanes Syndrom beschrieben wurde. Um einen besseren Einblick in die
potentiellen Funktionen der Wnt Faktoren während der Extremitäten-Entwicklung
zu bekommen, haben wir erstmals eine vollständige Expressionsanalyse aller 19
Wnt Gene der Maus sowie der wichtigsten sekretierten Antagonisten während der
Extremitäten-Entwicklung unternommen und konnten dabei zahlreiche neue
Expressions-Domänen beschreiben. Der Hauptfokus unserer Arbeit lag auf der
Analyse der Pathogenese einer Gruppe von Handfehlbildungen, den
Brachydaktylien. Der Ansatzpunkt zur Analyse dieser Krankheitsfamilie lag in
der Untersuchung der Funktion von ROR2, welches in der phänotypisch schwersten
Form, der Brachydaktylie Typ B1 (BDB1), Mutationen aufweist. Mutationen in
ROR2 verursachen jedoch nicht nur die dominante BDB1, sondern auch das
phänotypisch distinkte rezessive Robinow Syndrom (RRS). Um aufzuklären, wie
diese Mutationen zu verschiedenen Syndromen führen, stellten wir exakte Kopien
humaner Mutationen her und exprimierten diese in einem definierten Zellsystem.
Wir konnten zeigen, daß RRS Mutationen zu einer Retention des Proteins im
endoplasmatischen Reticulum und zur Proteindegradation führen. BDB1 Mutationen
jedoch sind stabil und gelangen an die Zellmembran, wo sie mit dem normalen
Signaling interferieren können. Durch exakte Quantifizierung der Proteinmengen
an der Membran konnten wir zeigen, daß die Schwere des BDB1 Phänotyps sowie
das Auftreten überlappenden Phänotypen zwischen BDB1 und RRS mit der Menge an
trunkiertem Protein an der Zellmembran korreliert. Ror2 ist eine Rezeptor-
Tyrosinkinase, für die zu Beginn unserer Arbeiten weder Ligand noch Signalweg
bekannt waren. Um einen Einblick in diese Prozesse zu erhalten und
intrazelluläre Interaktionspartner von Ror2 zu identifizieren, führten wir
einen Yeast-two-Hybrod Screen mit der intrazellulären Domäne von Ror2 durch.
Wir konnten zeigen, daß Ror2 mit einem LIM-Domänen Protein Wtip interagiert.
Diese Interaktion ist lokalisiert auf den C-Terminus von Ror2, welcher in
allen BDB1 Mutationen fehlt. Wir fanden, daß Ror2 in der Lage ist, Wtip an die
Zellmembran zu rekrutieren, BDB1-Formen von Ror2 jedoch nicht. Schließlich
fanden wir, daß Wtip ein neuer intrazellulärer Regulator des Wnt/-catenin
Signalweges ist, in den Ror2 (unter anderem von uns) in den vergangenen Jahren
involviert wurde. BDB1 ist charakterisiert durch Hypoplasie / Aplasie der
distalen Fingerglieder. Um die Pathogenese dieses Phänotyps zu untersuchen,
haben wir sowohl das Huhn als auch die Maus als Modellorganismus verwendet. Im
Huhn konnten wir mittels retroviraler Misexpression von trunkierten
Konstrukten (analog zu humanen BDB1 oder RRS Mutationen) zeigen, daß diese als
dominant-negative wirken, wobei korrelierend zu den Experimenten in Zellkultur
die RRS Mutationen einen schwächeren Effekt hatten. Wir beschrieben in diesem
System den Defekt in Wachstumsfugen langer Knochen und zeigten, daß dieser auf
einen Differenzierungsdefekt, nicht auf einen Proliferationsdefekt zurückgeht.
In diesem System konnten wir jedoch keinen BDB1-analogen Phänotyp erzeugen.
Dies gelang jedoch in einem Mausmodell, bei welchem eine humane Mutation
(p.W749X) durch knock-in in den endogenen Ror2-Locus eingebracht wurde. Wir
konnten in diesem Modell, das eine aplastische mittlere Phalanx aufweist,
zeigen, daß die BDB1 durch einen Elongationsdefekt der frühen
Knorpelkondensation der Hand und einem damit einher gehenden Defekt in der
Bildung des distalen Gelenks zustande kommt. Unsere Ergebnisse liefern somit
einen wichtigen Beitrag sowohl zur Erweiterung des Mutationsspektrums humaner
Extremitäten-Fehlbildungen als auch zur funktionellen und molekularen
Charakterisierung ihrer Pathogenese.
de
dc.description.abstract
Inheritable skeletal malformations are frequent in humans. In the recent years
we have analyzed several limb malformation syndromes. For two closely related
syndromes, Al-Awadi/Raas-Rothschild/Schinzel Phocomelia Syndrome and Fuhrmann
Syndrome we were able to identify the genetic cause. In both syndromes we
found recessive mutations in the gene encoding the signalling molecule WNT7A.
Functional assays demonstrated that mutations in Al-Awadi/Raas-
Rothschild/Schinzel Phocomelia Syndrome, showing a very severe phenotype, lead
to a complete loss of function, while mutations in the less severe Fuhrmann
Syndrome lead to a partial loss of function of the WNT7A protein. To gain
further insight into the roles of WNT signalling in limb development we have
performed a comprehensive expression analysis of all 19 mouse Wnt genes and
their major secreted antagonists during limb development and were able to
describe numerous novel expression domains. The main focus of our work,
however, was the analysis of the pathomechanism of a group of hand
malformations, the so-called brachydactylies (BDs). We therefore analyzed
ROR2, which is mutated in the most severe human brachydactyly, BDB1.
Importantly, mutations in ROR2 not only cause dominant BDB1, but also
recessive Robinow syndrome (RRS). We analyzed the genotype-phenotype
relationship for a range of BDB1 and RRS mutations in a defined cell system
and found that RRS mutations cause intracellular retention of the protein.
BDB1 mutations lead to the expression of proteins that are stably transferred
to the cell membrane where they can act as dominant-negatives. Exact
quantification of membrane-associated protein allowed a correlation between
the amount of protein at the surface and severity of the BDB1 phenotype. ROR2
is a receptor tyrosine kinase. To identify protein interaction partners, we
performed yeast-two-hybrid screening. We identified the LIM domain protein
WTIP as an intracellular interaction partner. BDB1 is characterized by
hypoplasia/aplasia of distal phalanges. We assessed the pathomechanism of BDB1
using the chicken and the mouse as model systems. Viral overexpression of
proteins carrying BDB1 mutations in the chick showed that these act as
dominant-negatives. A mouse model carrying the exact copy of a human BDB1
mutation (p.W749X) knocked into the mouse Ror2 locus recapitulated the BDB1
phenotype. This mouse showed aplasia of the middle phalanx in all digits,
which was caused by a failure of elongation of the initial condensation in the
autopode and a following failure of formation of a distal joint. In summary,
our results contributed to expanding the mutational spectrum of human limb
malformation syndromes and added to the functional and molecular
characterization of their pathogenesis.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
limb development
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Molekulargenetik und funktionelle Analyse embryonaler
Extremitätenfehlbildungen
dc.contributor.contact
strick_s@molgen.mpg.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. G. Rappold
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. A. Winterpacht
dc.date.accepted
2010-10-18
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000019707-1
dc.title.translated
Molecular genetics and functional analysis of embryonic limb malformations
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000019707
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000008505
dcterms.accessRights.dnb
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open access