Modulation of the humoral immune response by antithymocyte globulin (ATG)

Abstract

Antithymocyte globulin (ATG) is a polyclonal antibody preparation made by immunising rabbits with human thymus cells and purifying the IgG fraction. ATG is widely used in the treatment of acute organ rejection. The aim of this work was to study in vitro the effect of low-dose ATG on B-cell activation and differentiation to antibody-secreting cells, as this may have an effect on B cell-driven autoimmune diseases, such as pemphigus vulgaris. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and CD19+ B cells were isolated and cultivated with ATG and control rabbit IgG (rIgG). Supernatants were analysed for the presence of immunoglobulins by ELISA. Furthermore, proliferation and cytotoxicity were measured. B-cell differentiation surface markers and expression of developmental transcription factors were analysed using flow cytometry and polymerase chain reaction (PCR), respectively. The secretion of IgG, IgM and IgA in PBMC as well as in B cells was significantly reduced by treatment with ATG, but not control rIgG. This demonstrates that ATG is also effective in the absence of T cells and monocytes, and that the effects are not only mediated by e.g. inhibition of T-cell help. F(ab’)2 fragments of ATG proved to be nearly as potent in reducing the production of antibodies by B cells as unfragmented ATG, suggesting that the reduction of IgG is mediated by at least some specific effects of ATG, and not solely by unspecific binding to Fc receptors. Cell death of B cells was not elevated in the presence of low concentrations of ATG. On the contrary, ATG induced strong proliferation of B cells, perhaps due to synergistic effects of ATG and CpG, since TLR9, as well as CD40 and the B-cell receptor induce MAP kinase pathways and NFkB. Flow cytometry data suggest that ATG impairs the development of B cells towards antibody-secreting cells as there was a slight reduction in memory B cells and a significant reduction in plasmablasts, while the number of naive B cells was not affected. ATG not only decreased total IgG but also specific autoreactive IgG: Anti-Dsg3 in supernatants of PBMC from a patient with pemphigus vulgaris was decreased in the presence of ATG. This result indicates a possible clinical benefit of ATG for antibody-mediated diseases. Summing up, the results suggest that ATG at low concentrations inhibits B-cell differentiation and function and thereby modulates the humoral immune response without exerting significant cytotoxic effects.

Antithymozyten-Globulin (ATG) ist ein polyklonales Antiserum, das durch die Aufreinigung der IgG-Fraktion von Kaninchen gewonnen wird, die mit menschlichen Thymus-Zellen immunisiert wurden. ATG wird u. a. zur Behandlung von akuten Abstoßungsreaktionen nach Organtransplantation verwendet. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von niedrig-dosiertem ATG in vitro auf die Aktivierung von B-Zellen und Differenzierung zu Antikörper-sezernierenden Zellen zu untersuchen, da dies einen Effekt auf B-Zell-vermittelte Autoimmunerkrankungen wie Pemphigus vulgaris haben könnte. Mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (PBMC) und CD19+ B-Zellen wurden isoliert und mit ATG und Kaninchen-IgG (rIgG) als Kontrolle kultiviert. In den Überständen wurden dann mittels ELISA die Immunglobuline gemessen. Darüber hinaus wurden die Proliferation bzw. Zytotoxizität gemessen. B-Zell-Differenzierung und Transkriptionsfaktor-Expression wurden mittels Durchflusszytometrie bzw. PCR analysiert. Die Sekretion von IgG, IgM und IgA wurde durch die Behandlung mit ATG, aber nicht der Kontrolle rIgG sowohl bei PBMC als auch bei B-Zellen signifikant reduziert. Das zeigt, dass ATG auch in Abwesenheit von T-Zellen und Monozyten wirksam ist und dass die Effekte nicht durch z. B. die Hemmung der T-Zell-Hilfe vermittelt werden. F(ab’)2-Fragmente von ATG waren nahezu genauso potent bezüglich der Reduktion der Antikörper-Produktion von B-Zellen wie unfragmentiertes ATG, was darauf hinweist, dass die Verminderung von IgG zumindest teilweise durch spezifische Effekte des ATG vermittelt wird, und nicht nur durch unspezifische Bindung an Fc-Rezeptoren. Die Zellsterblichkeit wurde unter dem Einfluss niedriger Konzentrationen von ATG nicht erhöht. Somit ist zu vermuten, dass die inhibitorischen Effekte primär durch eine Immunmodulation und nicht durch Zytotoxizität vermittelt werden. ATG induzierte bei den B- Zellen eine starke Proliferation, was auf synergistische Wirkungen von ATG und CpG zurückzuführen sein könnte, da sowohl TLR9 als auch CD40 und der B-Zell-Rezeptor mitogen-aktivierte Proteinkinasen und NFkB induzieren. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie deuten darauf hin, dass ATG die Differenzierung von B-Zellen zu Antikörper-sezernierenden Zellen hemmt, da hier eine diskrete Reduktion der Gedächtnis-B-Zellen und eine deutliche Reduktion der Plasmablasten nachgewiesen wurde, während die Anzahl der naiven B-Zellen nicht vermindert war. ATG verminderte nicht nur das Gesamt-IgG, sondern auch spezifisches autoreaktives IgG: Anti-Dsg3 in Überständen von PBMC eines Patienten mit Pemphigus vulgaris wurde in der Gegenwart von ATG reduziert. Dieses Ergebnis deutet auf einen möglichen klinischen Nutzen von ATG bei antikörpervermittelten Erkrankungen hin. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass niedrig-dosiertes ATG die B-Zell-Differenzierung und Funktion hemmt und somit die humorale Immunantwort moduliert ohne signifikante zytotoxische Effekte auszuüben.