Physico-Biological Mechanisms of Focused Low-Intensity Pulsed Ultrasound in Musculoskeletal Regeneration

Abstract

Ultrasound is an inexpensive, portable, and real-time mode technique, which has generated increasing interest in the medical community not only for imaging purposes, but also for tissue regeneration. Low-Intensity Pulsed Ultrasound (LIPUS) has already been demonstrated to be a safe, non-invasive, non-ionizing clinical tool for bone regenerative treatment, recently showing potential for soft tissue repair as well. Although the benefits of LIPUS- induced biological effects have been explicitly demonstrated in vitro and in small animal models in vivo, a detailed understanding of the mechanism is still beyond our reach. Moreover, controversial findings in clinical trials limit the appreciation and use of this physical technique, which, in contrast to growth factors, has minimum side effects. In this thesis a novel focused LIPUS (FLIPUS) in-vitro set-up has been developed and characterized. The new set-up ensured deposition of well-defined acoustic intensity at the bottom of a 24-well tissue culture plates, minimizing the introduction of unwanted physical effects. It was first demonstrated that FLIPUS enhances the osteogenic potential of rat mesenchymal stem/stromal cells (rMSCs). Furthermore, an impact on the pro-osteogenic effects of FLIPUS was found due to both variation in the stimulation intensity levels and the age of the donor rMSCs. Murine pluripotent C2C12 mesenchymal precursors also exhibited mechanoresponse upon FLIPUS exposure, which was evaluated by the activity and the expression of the mechanosensitive transcription factors and genes, respectively. The activation of the transcription factors varied in a stimulation time-dependent manner. These findings suggest that the clinical LIPUS protocol, i.e., intensity level and stimulation time, might need optimization in accordance with, e.g., the patients’ age group. The fundamental mechanism of the FLIPUS-activated TEAD (transcriptional enhancer factor TEF-1) mechanosensitive transcription factor was further investigated, revealing the role of cell-geometry-regulated Yes-associated protein (YAP) in the mechanotransduction. FLIPUS was found to enhance proliferation of C2C12s, while delaying cellular myogenesis through YAP functioning. The understanding of the YAP-associated complete mechanotransductive mechanism of FLIPUS is underway. Owing to the arbitrarily adjustable acoustic beam properties of focused ultrasound and the ability to stimulate with well-characterized and defined intensity levels, the application of FLIPUS technology is planned to be extended to small animal models in vivo. The volume of FLIPUS energy can be adjusted to the size of the treated tissue region, enabling comprehension of the regenerative outcomes in direct response to variations in FLIPUS parameters. Co-application of FLIPUS with bone morphogenetic proteins (BMPs) is to be performed further in an attempt to enhance regeneration of the co- stimulated tissues with reduced concentrations of the growth factor. This approach is anticipated to decrease both the treatment costs and the risk of unwanted side effects of the growth factor application. Moreover, the imaging capability of focused ultrasound is planned to be combined with the regenerative properties of FLIPUS, leading to the development of a clinical device, which will allow for visual monitoring of the local tissue regeneration.

Ultraschall ist eine preiswerte und portable Echtzeit-Technik, die zunehmendes Interesse in der medizinischen Forschung, nicht nur für bildgebende Zwecke, sondern auch für die Geweberegeneration stößt. Gepulster Ultraschall mit niedrigen Intensitäten (engl.: Low-Intensity Pulsed Ultrasound – LIPUS) wird bereits klinisch als ein sicheres, nicht-invasives, nicht-ionisierendes klinisches Hilfsmittel zur Knochenregeneration eingesetzt. In den letzten Jahren konnte zudem sein Potential zur Reparatur von Weichteilgeweben gezeigt werden. Obwohl die Vorteile von LIPUS-induzierten biologischen Effekten in vitro und in Kleintiermodellen in vivo explizit gezeigt wurden, ist der genaue Wirkmechanismus noch nicht vollständig verstanden. Kontroverse Ergebnisse in klinischen Studien mindern derzeit die Wertschätzung und Anwendung dieser physikalischen Technik, die im Gegensatz anderen stimulierenden Methoden, z.B. der Anwendung von Wachstumsfaktoren minimale Nebenwirkungen hat. In dieser Dissertation wurde ein neues fokussiertes LIPUS (FLIPUS) in-vitro-System entwickelt und charakterisiert. Der Aufbau gewährleistet die reproduzierbare Applikation der gewünschten Ultraschallintensität am Boden von 24-Well- Gewebekulturplatten und minimiert die Übertragung von unerwünschten physikalischen Effekten. FLIPUS erhöhte die osteogene Differenzierung von mesenchymalen Stromazellen aus Ratten (rMSCs). Außerdem zeigten Veränderungen der Stimulationsintensitäten und das Alter der Zellspender einen Einfluss auf die pro-osteogenen Effekte von FLIPUS. Murine pluripotente C2C12 mesenchymale Zellen zeigten ebenfalls eine Antwort auf mechanische FLIPUS-Stimulation, die über die Aktivität bzw. Expression der mechanosensitiven Transkriptionsfaktoren bzw. -gene, ausgewertet wurde. Die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren variierte abhängig von der Stimulationszeit. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Optimierung der klinisch-angewandten LIPUS-Protokolle, insbesondere Intensität und Stimulationszeit, auf Faktoren wie bspw. die Altersgruppe der Patienten notwendig sind. Der grundlegende Mechanismus des durch FLIPUS aktivierten TEAD-Mechanosensitiven Transkriptionsfaktors wurde untersucht, wobei die entscheidende Rolle des zellgeometrie-regulierten Yes-assoziierten Proteins (YAP) bei der Mechanotransduktion entdeckt wurde. FLIPUS verbesserte die Proliferation von C2C12-Zellen und verzögerte die zelluläre Myogenese durch eine Erhöhung der YAP-Aktivität. Momentan wird der genaue YAP-assoziierte Mechanismus von FLIPUS erforscht. Aufgrund regulierbarer akustischer Strahlungseigenschaften von fokussiertem Ultraschall und der Fähigkeit, mit gut charakterisierten und definierten Intensitäten zu stimulieren, lässt sich FLIPUS in der Zukunft einfach an Kleintiermodellen in vivo anwenden. Die Energie von FLIPUS kann exakt auf die zu reparierende Gewebsgröße eingestellt werden, so dass Variationseffekte der FLIPUS-Parameter auf das regenerative Ergebnis nachvollziehbar werden. In Zukunft soll eine gemeinsame Anwendung von FLIPUS mit bone morphogenic proteins (BMPs) erprobt werden, um zum einen die Regeneration weiter zu steigern, zum anderen die Dosis von BMPs zu verringern. Es ist anzunehmen, dass sich somit sowohl die Behandlungskosten, als auch unerwünschte Nebenwirkungen der Wachstumsfaktoren verringern lassen. Darüber kann das bildgebende Potential des fokussierten Ultraschalls mit den regenerativen Eigenschaften von FLIPUS kombiniert werden, was das eine gezielte Stimulation und Überwachung der lokalen Geweberegeneration ermöglicht.