Structures of carbohydrate, cysteine and cystine binding receptors of ATP- Binding Cassette (ABC) Transporters

Abstract

ATP-Binding Cassette (ABC) transporters are integral membrane proteins carrying a variety of substrates across the cell membrane using energy provided by ATP hydrolysis. The minimal core complexes of ABC transporters consist of two transmembrane subunits (TMSs) that form a specific ligand transport pore and two cytosolic ATP-binding subunits (ABSs) that bind and hydrolyse ATP to provide the energy for the translocation of substrate across the cell membrane. In addition to these core subunits, canonical prokaryotic ABC-importers require a periplasmic binding protein (PBP) or receptor, which traps the substrate in the periplasm and delivers it to the external face of the transport complex. In this study, general purification methods were established for obtaining functional prokaryotic ABC importers ArtM2P2 (arginine, lysine and histidine), HisQMP2 (arginine, lysine, ornithine and histidine), Ngo0373/0374 (L-cystine) and Pro(WX) 2V2 (glycine betaine, proline betaine). These importers were biochemically characterized and used for crystallization trials that were, however, not suitable for a X-ray analyses. In parallel, several conjugate periplasmic substrate receptors were co- crystallized with their ligands and further structurally analyzed concerning their substrate specificity. The structural analyses included the receptor proteins of: (i) The acarbose receptor GacH from Streptomyces glaucescens that was co-crystallized with specific acarbose homologs and acarbose, and the maltose receptor MalE from Salmonella typhimurium was cocrystallized with acarbose and the structure elucidated. These structures provide insight into the acarbose carbophor cycle of Streptomyces glaucescens and suggest that the uptake of acarbose by competitor microorganisms is coupled with ABC transporter. (ii) The structure of the galactose receptor AcbH from Actinoplanes sp was obtained with β-D-galactopyranose in the binding pocket, and the receptor was found to exhibit a very specific substrate preference for this sugar. This opposes the previous finding which regarded AcbH as an acarbose binding protein. (iii) Lastly two solute receptors for L-cystine and L-cysteine, respectively, from N. Gonorrhoeae were solved in complex with their ligands, and their binding pockets were compared with respect to their substrate specificity. These X-ray structures of receptors in complexes with their ligands provide detailed insight into the arrangements of binding pockets for substrate specificity and information regarding their extracellular role in the translocation of these substrates.

ATP-Binding Cassette (ABC)-Transporter sind integrale Membranproteine, die verschiedene Substrate durch die Zellmembran unter ATP-Verbrauch transportieren. Die minimalen Kern-Komplexe von ABC-Transportern bestehen aus zwei Transmembran-untereinheiten (TMU), die eine spezifische Pore für Liganden bilden sowie aus zwei ATP-bindenden Untereinheiten (ABU), die die Energie für den Transport durch Hydrolyse von ATP gewinnen. Zusätzlich zu diesen Kern- Untereinheiten benötigen prokaryotische kanonische ABC-Importer ein periplasmatisches Bindeprotein (PBP) oder einen Rezeptor, der das Substrat im Periplasma bindet und an die Außenseite des Transport-Komplexes transportiert. In dieser Arbeit wurde die Expression und Aufreinigung der prokaryotischen ABC Importer ArtM2P2 (Arginin, Lysin und Histidin), HisQMP2 (Arginin, Lysin, Ornithin und Histidin), Ngo0373/0374 (L-Cystin) and Pro(WX) 2V2 (Glycin Betain, Prolin Betain) etabliert. Die Importer wurden biochemisch charakterisiert und für Kristallisationsversuche verwendet, jedoch wurden keine für die Röntgenstrukturanalyse geeigneten Kristallen erhalten. Parallel dazu wurden mehrere Komplexe von periplasmatischen Substrat-Rezeptoren mit ihren Liganden co-kristallisiert und ihre Strukturen hinsichtlich Substratspezifität analysiert. Es wurden folgende Strukturen erhalten: (i) Acarbose-Rezeptor GacH aus Streptomyces glaucescens mit verschiedenen Acarbose-Homologen und Acarbose, und der Maltose-Rezeptor von Salmonella typhimurium wurde mit Acarbose co-kristallisiert und die Strukturen aufgeklärt. Diese Strukturen geben Einsichten in den Acarbose Carbophor Zyklus von Streptomyces glaucescens und lassen vermuten, dass die Aufnahme von Acarbose durch konkurrierende Mikroorganismen an ABC-Transporter gekoppelt ist. (ii) Die Struktur des Galactose-Rezeptors AcbH aus Actinoplanes sp wurde mit β-D-galactopyranose in der Bindungstasche erhalten. Es konnte festgestellt werden, dass dieser Rezeptor höhe Spezifität für diesen Zucker zeigt. Dies widerspricht der vorherigen Ansicht, dass AcbH ein Acarbose bindendes Protein ist. (iii) Des weiteren wurden die Strukturen zweier Substratrezeptoren für L-Cystin bzw. L-Cystein aus N. gonorrhoeae im Komplex mit ihren Liganden aufgelöst und ihre Bindungstaschen wurden in Bezug auf ihre Substratspezifität verglichen. Die gewonnen Daten dieser Arbeit geben einen neuen und detaillierten Einblick in den Aufbau verschiedene Bindungstaschen und liefern Informationen über deren Substratspezifität sowie die extrazellulären Funktionen in der Translokation dieser Substrate.