Vergleichende Röntgenstrukturanalysen von Nukleinsäuren

Abstract

Hochaufgelöste Strukturen von Nukleinsäuren geben Aufschluss über die Konformation, Hydratation und Ligandenbindung der Moleküle. Als Modellsysteme für natürliche Nukleinsäuren wurden zwei tRNA-Akzeptorstämme und zum Vergleich eine davon abgeleitete modifizierte „locked“ Nukleinsäure untersucht. Um eine maximale Auflösung der Strukturen zu erzielen, wurden Kristallisationsansätze unter Mikrogravitationsbedingungen durchgeführt und gleichzeitig die Länge der untersuchten Moleküle auf sieben Basenpaare begrenzt. Anhand der Struktur des tRNAArg-Akzeptorstammes konnte beispielhaft die Bindung von kleinen Molekülen an einfache Nukleinsäurefaltungsmotive gezeigt werden. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit Untersuchungen zur basen-spezifischen Bindung von kleinen Molekülen an Aptamere und Riboswitches. Die Struktur des tRNASer- Akzeptorstammes weist durch ihre hohe Auflösung von 1,2 Å eine nahezu vollständige Hydratation aller Basenpaare auf. Da der Akzeptorstamm von tRNAs wesentliche Identitätsmerkmale für die Erkennung durch die korrespondierenden Aminoacyl-tRNA-Synthetasen trägt, konnte durch einen Vergleich mit einem Isoakzeptor der Einfluss des Wassernetzwerkes auf die Interaktion mit natürlichen Bindungspartnern untersucht werden. Dies wurde durch eine Superpositionierung der beiden Isoakzeptoren mit der Seryl-tRNA-Synthetase bestätigt und ausgeweitet. Die Sequenz und Struktur des tRNASer- Akzeptorstammes stellten die Grundlage für die Untersuchung der davon abgeleiteten Struktur einer „locked“ Nukleinsäure hinsichtlich Konformation, Hydratation und Ligandenbindung dar. Dies ermöglichte einen sequenzunabhängigen Vergleich der LNA mit der korrespondierenden RNA. Dabei zeigte sich, dass die LNA eine vorher nicht beschriebene Doppelhelixstruktur einnimmt, aus der heraus Gründe für die hohe thermische Stabilität dieser Nukleinsäureklasse abgeleitet werden konnten. Die Duplex ist im Vergleich zur RNA durch eine Streckung bei gleichzeitiger Öffnung charakterisiert, was konformationell eher anderen modifizierten als der natürlichen Nukleinsäure ähnelt. Trotz der strukturellen Unterschiede gleichen das Hydratationsmuster und das Ligandenbindungsverhalten in weiten Bereichen dem der natürlichen Nukleinsäure.

High-resolution X-ray crystallography of nucleic acids is a powerful method to investigate conformation, hydration and ligand-binding of these molecules. Two tRNA-acceptorstem-microhelices where employed as model systems for natural nucleic acids and compared to a modified “locked” nucleic acid, which sequence was derived from one of those acceptorstems. Oligonucleotides were restricted to a length of seven base pairs and crystallization was even performed under microgravity conditions to maximize resolution of the structures. The structure of the tRNAArg acceptorstem can be seen as a model for the binding of small molecules to simple structural motifs of nucleic acids. The results are consistent with investigations on base-specific interactions of small molecules with aptamers and riboswitches. Due to its high resolution of 1.2 Å, the structure of the tRNASer acceptorstem reveals a nearly complete hydration of all base pairs. Since tRNA acceptorstems carry important identity elements for the interaction with the cognate aminoacyl-tRNA-synthetase, a comparison with an isoacceptor yielded insight into the impact of the hydration network for the interaction of tRNAs with other molecules. These findings were confirmed and extended by a superposition of the two isoacceptors with the seryl-tRNA-synthetase. The highly-resolved structure of the tRNASer acceptorstem was the fundament for the investigation of a “locked” nucleic acid. The sequence of the LNA was derived from the acceptorstem. This allowed a sequence independent comparison of the modified nucleic acid with its corresponding natural counterpart. The structure was investigated with focus on conformation, hydration and ligand-binding. It could be demonstrated, that the LNA shows a double helix geometry, which differs significantly from natural nucleic acids and can be rather brought in vicinity to other modified nucleic acids. The structure of the LNA duplex can be described as a stretched helix with an enlarged helical pitch. Despite these structural differences the hydration and ligand-binding ability of the modified nucleic acid are similar to those observed in RNA.