Rolle des Connective Tissue Growth Factors (CTGF) und des PKC-enhanced Protein-Phosphatase 1 Inhibitors (KEPI) für die Funktion des adulten Herzen: Studien an transgenen Tiermodellen

Abstract

1 Zusammenfassung I Connective tissue growth factor (CTGF) ist ein sekretorisches Protein, das bei verschiedenen experimentellen Modellen sowie während der humanen Herzinsuffizienz stark induziert ist. Die Überexpression von CTGF steht im Zusammenhang mit einer Akkumulation der extrazellulären Matrix in humanen atheriosklerotischen Läsionen, nach myokardialem Infarkt sowie im vaskulären und kardialen Gewebe bei experimentellem Bluthochdruck. Die starke Überexpression sowie die Assoziation mit der Bildung der extrazellulären Matrix, lässt eine essentielle Rolle von CTGF bei fibrotischen Prozessen vermuten. Im Rahmen dieser Studie wurde die Rolle von CTGF bei der kardialen Funktion sowie Fibrosebildung untersucht. Um den Einfluss von CTGF im Myokardium zu untersuchen, wurde ein transgenes Mausmodell mit herzspezifischer CTGF-Überexpression generiert. In vivo Untersuchungen zeigten bei CTGF-transgenen- verglichen mit Wildtyp-Mäusen eine unveränderte kardiale Funktion ohne einen Anhalt für eine kontraktile Dysfunktion. Die Herzmorphologie und –gewicht blieben ebenso unverändert. Eine mögliche Relevanz von CTGF in kardialen Belastungssituationen wurde im Modell der Angiotensin II induzierten Hypertrophie untersucht. Dieser Ansatz zeigte, dass CTGF-überexprimierende Mäuse eine im Vergleich zum behandelten Wildtyp besser erhaltene kontraktile Funktion aufweisen. Der Grad der Hypertrophie und der kardialen Fibrose blieb in der transgenen Maus unverändert. Eine weiterführende Analyse des intrazellulären Ca2+-Transienten in CTGF-transgenen Kardiomyozyten erbrachte einen signifikant niedrigeren diastolischen intrazellulären Ca2+-Gehalt im Vergleich zum Wildtyp, was sich potentiell protektiv auf die Kontraktilität unter Hypertrophie-Bedingungen auswirken kann. Die genannten Daten liefern eine Evidenz, dass CTGF kein Schlüsselaktivator für Fibrose ist. Vielmehr unterstützen die folgendenden Ergebnisse eine neue Funktion von CTGF als kardioprotektiver Faktor bei ventrikulärer Hypertrophie. Dieser protektive Effekt beruht möglicherweise auf einer CTGF-abhängigen Verbesserung des intrazellulären Ca2+- Haushalts. Die genaue Funktion von CTGF beim Ca2+-Handling des Kardiomyozyten bleibt Gegenstand weiterer Forschung. 2 Zusammenfassung II Die Funktion des Herzmuskels wird durch ein feines Gleichgewicht zwischen Phosphorylierung und Dephosphorylierung von verschiedenen Effektorproteinen reguliert. Dazu gehören Phospholamban, Ryanodin Rezeptor, L-Typ-Ca2+-Kanal und Troponin I. Während die Rolle der Kinasen bei der Herzkontraktion relativ gut erforscht ist, ist die Bedeutung der Phosphatasen und ihrer regulatorischen Proteine nur unzureichend charakterisiert. Dies ist die erste Studie, welche die kardiale Funktion von KEPI (Protein Kinase C enhanced protein phosphatase type 1 inhibitor) erläutert. KEPI ist ein kürzlich identifiziertes Protein, welches inhibitorisch auf die essentielle kardiale Phosphatase, die Protein Phosphatase1 (PP1), wirkt. In Gen-Chip-Analysen eines Mausmodells für dilatative Kardiomyopathie (ErbB2-KO) zeigte KEPI eine signifikante Herunterregulation. Mittels der in situ-Hybridisierung wurde die embryonalle Expression von KEPI charakterisiert. Um Bindungspartner von diesem Protein zu ermitteln wurden Pull down-Experimente und Massenspektrometrie durchgeführt. Die funktionelle Rolle von KEPI wurde in einem Mausmodell mit herzspezifischer KEPI-Überexpression sowie im Zebrafisch mit einem KEPI-knock down ermittelt. Die KEPI-mRNA war am Tag 8.5 im Ausflusstrakt, am Tag 10.5 in den Ventrikeln und schließlich am Tag 14.5 im gesamten Herzen detektierbar. Mittels der Pull down-Experimente und Massspektrometrie wurde Troponin I als ein neuer Bindungspartner von KEPI identifiziert. Die KEPI-transgenen Mäuse zeigten in der Echokardiographie keine Veränderung der Kontraktilität im Basalzustand, wiesen aber Modifikationen des EKG nach ß-adrenerger Stimulation (verkürztes QT-Interval) auf. Darüber hinaus entwickelten isolierte KEPI-transgene Kardiomyozyten eine gesteigerte kontraktile Funktion sowie einen verstärkten Ca2+-Transienten. Interessanterweise führte der knock down von KEPI im Zebrafisch zu einer verlangsamten Herzschlagrate und deutlichen perikardialen Ödemen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass KEPI ein neues modulatorisches Protein im Herzmuskel ist. Seine Interaktion mit Troponin I lässt auf seine entscheidende Rolle bei der kontraktilen Funktion schließen. Der Phänotyp der transgenen Maus sowie des Zebrafisches deuten auf eine große physiologische Relevanz von KEPI hin. Weiterführende Experimente an Knockout und transgenen- KEPI Mäusen werden in der Zukunft bei der Aufklärung der Rolle im Herzen behilflich sein.

Abstract I Connective tissue growth factor (CTGF) is a secretory protein being strongly induced in various experimental models as well as in human heart failure. The overexpression of CTGF is robustly associated with the accumulation of the extracellular matrix in human atherosclerotic lesions, after myocardial infarction and in myocardial and vascular tissue in experimental hypertension. Both, the strong induction in fibrotic disorders as well as the association with the formation of the extracellular matrix implies an essential contribution of CTGF in the pathogenesis of fibrosis. The aim of this study was to elucidate the role of CTGF in the cardiac function and fibrosis formation. In order to determine the impact of CTGF on the myocardium a transgenic mouse model with heart specific CTGF overexpression was generated. In vivo experiments revealed an unchanged cardiac function in transgenic mice compared to wild type without an indication of contractile dysfunction. The heart morphology and weight remained also unaltered. The relevance of CTGF for the cardiopathogenesis was examined in the Angiotensin II induced cardiac hypertrophy model. In this experimental setting the CTGF overexpressing mice exhibited a better preserved contractile function than the wild-type mice. However, both, treated wild type and transgenic mice displayed hypertrophy and cardiac fibrosis to the same extent. Further analyses of intracellular Ca2+-transients indicated a reduced cytosolic Ca2+ content during the diastole in transgenic cardiomyocytes. This may result in a protective effect on the contractile function under hypertrophic conditions. This data provide evidence, that CTGF itself is not able to induce fibrosis. Moreover, these results imply a new function of CTGF as a cardioprotective factor in hypertrophy. The protective effect of CTGF is possibly based on its action on intracellular Ca2+-cycling. The comprehensive understanding of CTGFs role in Ca2+-handling remains an object of further investigation. Abstract II Cardiac muscle function is regulated by a tight balance between phosphorylation and dephosphorylation of different regulatory phosphoproteins like phospholamban, the ryanodine receptor, L-type Ca2+ channel and troponin I. The role of protein kinases in cardiac contractility has been well characterized, whereas the importance of phosphatases and their regulatory proteins is poorly understood. This is the first study elucidating the cardiac function of KEPI (Protein Kinase C enhanced protein phosphatase type 1 inhibitor), which is a recently identified protein with inhibitory properties on the crucial cardiac phosphatase called PP1 (Protein Phosphatase 1). KEPI was significantly down regulated in murine hearts with dilated cardiomyopathy as detected by Gene-Chip-Arrays. Using in situ hybridization the embryonic expression of KEPI was characterized in the heart. To assay for binding partners of KEPI pull down experiments were performed. The functional significance of KEPI in the heart was analyzed in a mouse model with heart specific KEPI-overexpression as well in zebra fish using the morpholino knock down technology. KEPI mRNA was detected at day 8.5 pf in the heart outflow tract and spread out at day 10.5 to the ventricles and finally at day 14 to the whole heart. Using pull down experiments and mass spectrometry the binding of KEPI to Troponin I was identified. The KEPI-overexpressing mice did not show altered cardiac function as assayed by echocardiography, but developed changes in ECG after ß-adrenergic stimulation (shorter QT interval). Moreover, single isolated KEPI-transgenic cardiomyocytes displayed an increased contractile function and an enhanced intracellular Ca2+-transient. Interestingly, the knock down of KEPI in zebra fish led to a lower heart rate as well as pronounced edema in the heart region in morphants compared to wild type fish. Taken together, KEPI is a novel protein with modulatory function in cardiac muscle. Its association with troponin I suggests a crucial importance in cardiac contractile function. The observed phenotype in mouse and fish indicates a large physiological significance of this protein. The ongoing experiments including knockout and transgenic mouse models will help to clarify the role of KEPI in the heart.