Einfluss von „Endothelial Colony Forming Cells“ (ECFC) auf das zerebrale Kollateralgefäßwachstum bei der Maus

Abstract

Hintergrund/Ziel: Die hämodynamische zerebrale Perfusionsminderung gilt als Risikofaktor für einen Schlaganfall bei Patienten mit arterieller Verschlusskrankheit der Hirnarterien und trägt mit 10 % zu diesem bei. Als Hauptursache für eine hämodynamische Perfusionseinschränkung wurde der Verschluss der A. carotis interna mit einem jährlichen Risiko für einen ischämischen Schlaganfall von 5,5–10 % identifiziert. Die Ausbildung eines primitiven Gefäßnetzwerkes wurde in vitro durch Endothelvorläuferzellen, Endothelial Colony Forming Cells (ECFC), gezeigt. Das Ziel dieser Arbeit ist es, das Potential ex vivo expandierter ECFC zum in vivo Gefäßwachstum (Arteriogenese) der Hirnarterien mit funktioneller Wiederherstellung des zerebralen Blutflusses zu untersuchen. Methoden: In einem mehrschrittigen Versuchsaufbau wurde als erstes das Modell der chronisch zerebralen Hypoperfusion (unilaterale Okklusion der A. carotis interna und externa, OACI/E) bei weiblichen NuNu-Mäusen etabliert (Sham vs. OACI/E). In einem zweiten Experiment wurden NuNu-Mäuse zufällig in die Gruppen entsprechend der Behandlung eingeteilt: ECFC HD (hochdosiert, 1x10e6 Zellen), ECFC (niedrigdosiert, 3x10e5 Zellen), HUVEC (biologische Kontrolle, 3x10e5 Zellen) und Phosphate Buffered Saline (PBS, Kontrolle mit der zellfreien Trägerflüssigkeit). Die intravenösen Injektionen erfolgten an den Tagen 0, 3 und 7. In allen Gruppen wurden die Ruheperfusion und die zerebrovaskuläre Reservekapazität mittels Laser Speckle Bildgebung an den Tagen 0, 3, 7 und 14 gemessen. Im Anschluss wurden die basalen und leptomeningealen Hirngefäße aller Tiere an Tag 21 mit Hilfe der Latexangiographie dargestellt. Die Analyse der Mikrogefäßarchitektur (CD31, Desmin, α-SMA, Ki-67) erfolgte an Tag 7 in einer separaten Kohorte durch Immunfluoreszenzmikroskopie. Die Analyse der ECFC-Inkorporation in den Wirt nach vorangegangener DiI-Färbung erfolgte in vitro (Immunhistochemie) und in vivo (transkraniale Intravitalmikroskopie). Ergebnisse: Die erfolgreiche Etablierung des Modells wurde mit einer signifikanten Minderung der CVRC über die gesamte Versuchsdauer belegt (P<0.05, OACI/E vs. Sham). Im Modell der chronisch zerebralen Hypoperfusion bewirkten ECFC eine funktionelle Wiederherstellung der CVRC (P<0.05, ECFC HD vs. PBS; ECFC HD vs. HUVEC). Dieser Effekt zeigte sich in Abhängigkeit der Dosis und wurde nur in der hochdosierten ECFC-Gruppe beobachtet (CVRC, hochdosiert: 39,9±10 %, niedrigdosiert: 32,7±15 %). Als anatomisches Korrelat wurde ein Anstieg der Anzahl der leptomeningealen Anastomosen (P<0.05, ECFC HD vs. übrige Gruppen) und der Gefäßdurchmesser (P<0.05, ECFC HD vs. ECFC) identifiziert. Die Effizienz der leptomeningealen Arteriogenese spiegelte sich durch ausbleibendes Gefäßwachstum auf basaler Makrogefäßebene wider. Schlussfolgerung: ECFC haben im Rahmen der chronisch zerebralen Hypoperfusion das Potential zur funktionellen Wiederherstellung des zerebralen Blutflusses. Diese Effekte zeigen sich in Abhängigkeit von der applizierten ECFC-Dosis. Eine Kompensation des zerebralen Blutflusses auf leptomeningealer Ebene scheint der basalen überlegen zu sein.

Objectives: Decrease in hemodynamic cerebral perfusion was found as a risk factor for stroke in patients with arterial occlusive disease and contributes to ischemic strokes in 10 % of the case. Occlusion of the internal carotid artery is identified as a major cause of hemodynamic compromise with an annual stroke risk of 5.5–10 %. In vitro formation of a primitive vascular network has been shown in endothelial progenitor cells, endothelial colony forming cells (ECFC). The aim of the present study is to evaluate the impact of ex vivo expanded ECFC in in vivo vessel growth (arteriogenesis) in cerebral blood vessels and functional recovery of cerebral blood flow. Methods: First a model of cerebral hypoperfusion (unilateral occlusion of the internal and external carotid artery, OACI/E) in female NuNu-mice was established (Sham vs. OACI/E). In a second experiment NuNu-mice were divided randomly in subsequent groups: ECFC HD (high-dose, 1x10e6 cells), ECFC (low-dose, 3x10e5 cells), HUVEC (biological control, 3x10e5 cells) and Phosphate Buffered Saline (PBS, control with cell-free medium). All injections were performed intravenously at day 0, 3 and 7. In all groups cerebral baseline perfusion and cerebrovascular reserve capacity (CVRC) were measured at days 0, 3, 7 and 14 by laser speckle imaging. Following analyses of basal and leptomeningeal vessels of the same animals were performed by latexangiography at day 21. Microvasculature (CD31, Desmin, α-SMA, Ki-67) was analysed at day 7 in a separate group by immunofluorescence microscopy. Host vessel interaction of DiI-labeled ECFC was analysed in vitro (immunohistochemistry) in vivo (transcranial intravitalmicroscopy). Results: Successful model establishment was proved by a constant, significant decrease in CVRC during the whole experimental time (P<0.05, OACI/E vs. Sham). ECFC- injection resulted in a functional recovery of CVRC in a model of chronic cerebral hypoperfusion (P<0.05, ECFC vs. PBS; ECFC vs. HUVEC). This effect is dose-dependent and only observed in the high-dose group (CVRC, high-dose: 39.9±10 %, low-dose: 32.7±15 %). These results paralleled with an increase in leptomeningeal anastomosis (P<0.05, ECFC HD vs. other groups) and vessel diameter (P<0.05, ECFC HD vs. ECFC). Efficiency of leptomeningeal arteriogenesis was attended by absence of growth in basal macrovasculature. Conclusion: In cerebral hypoperfusion ECFC potential to functional recovery of cerebral blood flow was shown. These dose-dependent effects seem to be more efficient in blood flow compensation in leptomeningeal levels compared to basal ones.