Vergleichende in vivo- und in vitro-Analysen im Rahmen der Etablierung der kombinierten Leber- und Leberzelltransplantation im Rattenmodell

Abstract

Die orthotope Lebertransplantation (LTx) gilt als Standardtherapie bei terminaler Leberinsuffizienz. Trotzdem existieren weiterhin gravierende Probleme auf diesem Gebiet. So steht derzeit u.a. die meist lebenslange Immunsuppression mit ihren Folgeerkrankungen im Fokus der Forschung. Das Ziel des Projektes, dem diese Arbeit angehört, ist es, durch eine kombinierte Leber- und Leberzelltransplantation, ein Spenderorgan zu schaffen, das vom Immunsystem des Organempfängers voll toleriert wird. Hierdurch wären die Probleme einer lebenslangen Immunsuppression gelöst. Um dieses Ziel zu erreichen, sollen erstmals neben einer allogenen Spenderleber auch autologe Hepatocyten sowie autologe hepatische Progenitorzellen (hPc) transplantiert werden. Es wird postuliert, dass die autologen Spenderzellen in der Lage sind, das allogene Spendertransplantat suffizient zu repopularisieren und damit zur Bildung des oben beschriebenen Organs zu führen. Als vorklinische Studie wurde im Rattenmodell die allogene Leber einer weiblichen Dark Agouti Ratte (DA-f) in eine weibliche Lewis-Ratte (Lew-w) transplantiert. Als autologer Spender für die kombinierte Zelltransplantation dienten männliche Lewis-Ratten (Lew-m) des gleichen Inzuchtstamms. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich damit, essentielle Methoden zur Durchführung des Projekts zu etablieren und ihre Ergebnisse zu analysieren und zu vergleichen. Zur Realisierung des Vorhabens wurde ein Proliferationsvorteil der autologen Spenderzellen gegenüber den Zellen des allogenen Spenderorgans induziert. Um die Proliferation der Hepatocyten im allogenen Spenderorgan zu unterdrücken, wurde den Organspender- Tieren der Mitose-Hemmstoff Retrorsin verabreicht. Mit Hilfe histologischer Methoden konnte gezeigt werden, dass am 45. Tag nach Retrorsin-Gabe die Zellproliferation im Spenderorgan (DA-f) fast völlig zum Erliegen kommt und sich dieser Tag am besten für die Transplantation eignet. Zur Proliferationsinduktion sowie zur Induktion von hPc in der Leber des Leberzellspenders (Lew m) wurden die Tiere durch die Applikation eines 2-Acetylaminofluoren (2AAF)-Pellets sowie eine 6 Tage später folgende partielle Hepatektomie (PH) vorbehandelt. Es konnte hierdurch gezeigt werden, dass am 9. Tag nach PH mit der größtmöglichen Anzahl an hPc und der höchsten Proliferationsrate zu rechnen ist. Es zeigten sich keine wesentlichen Unterschiede zwischen Mono- und Kokultur von adulten Hepatocyten und Vorläuferzellen. Um die transplantierten Zellen im Spenderorgan nachzuweisen und die Repopularisierung des Organs zu verfolgen, wurden Fluoreszenz in situ Hybridisierung und die quantitative Polymerase-Kettenreaktion zum spezifischen Nachweis von auf den Y-Chromosomen befindlichen DNA-Abschnitten etabliert und hinsichtlich ihrer Validität verglichen. Durch beide Methoden konnte erfolgreich gezeigt werden, dass die postulierte Repopularisierung des allogenen Spenderorgans mit autologen Spenderzellen bis Tag 90 stattfindet. Des Weiteren stellte sich heraus, dass die tatsächliche Repopularisierung und Proliferation erst ab dem 30. Tag nach stattgehabter Leber- und Leberzelltransplantation beginnt. Durch die Ergebnisse dieser Arbeit konnten wichtige Fragen beantwortet und essentielle Grundlagen zur weiteren Durchführung des Projekts der Bildung eines voll autologisierten Lebertransplantats geschaffen werden.

Orthotope liver transplantation (LTx) is the standard therapy for end-stage liver disease. However it is associated with several problems, e.g. life-long immunosuppressive therapy and its consequences, which are major subjects in current research. The aim of the project, which this work is part of, is to create a donor organ that is completely tolerated by the immune system of the recipient by performing a combined liver- and liver-cell-transplantation. To reach this point an allogeneic donor liver, autologous adult hepatocytes and autologous hepatic progenitor cells (hPc) shall be transplanted together for the first time. It is postulated that the autologous donor cells will sufficiently repopulate the allogeneic donor organ. This will lead to operational tolerance, as described above. In a preclinical rat model the allogeneic liver of a female Dark Agouti rat (DA-f) was transplanted into a female Lewis rat (Lew-f). The autologous cells of a syngeneic male Lewis rat (Lew-m) were used for the combined cell transplantation. This dissertation describes implementation and establishment of essential methods for the project and analyzing its results. To realize this project a proliferation advantage of the autologous donor cells towards the allogeneic cells of the donor organ was induced. By using Retrorsin, a cell-cycle inhibitor, the proliferation of hepatocytes in the allogeneic donor organ was restrained. Histology showed that there is nearly no cell proliferation left in the donor organ (DA-f) at the 45th day after Retrorsin application. So this is the best day to perform organ transplantation. To induce proliferation and a valuable level of hPc in the liver of the cell donor (Lew-m), the rats received 2-Acetylaminofluorene (2-AAF) pellets and underwent subsequent partial hepatectomy (PH) 6 days after. Results showed that the highest amount of hPc and cell proliferation is found on the 9th day after PH. No severe differences were noted between mono- and co-culture of adult hepatocytes and progenitor cells. To detect transplanted cells and validate the repopulation of the organ, fluorescence in situ hybridization (FisH) and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) were implemented and compared for specific detection of DNA segments only found on chromosome Y. Both methods proved that the postulated repopulation of an allogeneic donor organ with autologous donor cells occurs up to day 90 after combined organ and cell transplantation. Additionally it was shown that repopulation and proliferation of autologous donor cells starts after the 30th day after combined liver- and liver cell transplantation. With this work severe problems were solved and essential basics for the implementation of a fully autologous liver graft were established.