Phenotypic variability in monogenic disorders involving skeletal malformations

Abstract

Understanding phenotypic variability in Mendelian disorders is important to dissect the underlying disease mechanisms and owns high relevance for genetic counseling. However, it is influenced by many factors that are often complex and difficult to dissect, leaving the molecular causes often obscure. This work aimed to explain the variability observed in several monogenic disorders with limb phenotypes. Mutations in ROR2 can give rise to two distinct human diseases: recessive Robinow syndrome (RRS) and dominant Brachydactyly type B1 (BDB1) with variable severity. A homozygous patient carrying a novel nonsense mutation in ROR2 (c.1324C>T; p.R441X) reported here, however, exhibits features of RRS in conjunction with severe recessive brachydactyly. Membrane protein fraction quantification of this mutation together with wild-type, BDB1 and RRS mutant protein revealed a gradient of distribution and stability correlating with the clinical phenotypes: RRS mutant protein was retained intracellularly, whereas BDB1 mutant protein localised at the plasma membrane in varying amounts, correlating with the severity of the BDB1. The novel mutation showed an intermediate behaviour. In heterozygous carriers of the p.R441X mutation the amount of mutant protein at the plasma membrane is insufficient to cause dominant BDB1, however, it leads to severe recessive brachydactyly in conjunction with RRS features in the homozygous state. This gradual model was confirmed by crossing mouse models for RRS and BDB1, yielding double heterozygous animals that exhibited an intermediate phenotype. A second project was concerned with the effect of genetic background on phenotype penetrance. The dominant allele of the so-called modifier of dactylaplasia (Mdac) completely suppresses the ectrodactyly phenotype of dactylaplasia (dac) mice, the model for human split hand and foot malformation 3 (SHFM3). A conclusive theory about the identity and the mode of action of Mdac was developed, after limiting the candidates by classical linkage and in silico analyses based on SNP strain distribution patterns (SDPs). In addition, molecular consequences of the dac mutation in respect to signaling and development were examined. Thorough analyses confirmed that increased apoptosis leads to the loss of the median apical ectodermal ridge (AER) and subsequently the ectrodactyly phenotype. This effect is most likely due to a reduction in canonical Wnt-signaling, as indicated by the downregulation of Lef1 and the reduced amount of activated β-catenin observed in the AER. However, the direct molecular cause for this deregulation could not be identified so far. Therefore, a protocol was developed that allows the clean dissection of apical ectodermal ridges. Expression analyses of this tissue at different stages will confirm deregulated signaling pathways identified in other experiments and may elucidate the identity of genes initially influenced by dac.

Das Verstehen von phänotypische Variabilität in Mendelschen Erkrankungen ist für die genetische Beratung relevant und hilft, die zu Grunde liegenden Krankheitsbilder zu verstehen. Allerdings sind in den meisten Fällen diese Einflüsse sehr komplex und schwierig zu analysieren, so dass die molekulare Ursache der Variabilität häufig ungewiss bleibt. Diese Arbeit soll nun helfen, die phänotypische Variabilität zweier monogenetischer Erkrankungen mit Skelettfehlbildungen zu klären. Abhängig von Position und Art können Mutationen in ROR2 entweder zu dominant vererbten Brachydaktylie Typ B1 oder rezessiven Robinow Syndrom führen, die normalerweise durch unterschiedliche Ausprägungsmerkmale klar voneinander unterschieden werden können. Allerdings zeigt ein homozygoter Patient mit einer neuen Nonsens-Mutation in ROR2 (c.1324C>T; p.R441X) einige Merkmale des RRS zusammen mit einer schweren, rezessiven Brachydaktylie. Quantifizierung des Membran-gebundenen Anteils von diesem mutantem Protein zusammen mit Wildtyp, BDB1- und RRS-mutantem ROR2 ergab einen Gradienten in Verteilung und Stabilität, die mit den klinischen Phänotypen korrelierte: RRS-mutantes Protein wurde intrazellulär zurückgehalten, wohingegen BDB1-mutantes Protein in unterschiedlichen Mengen an der Plasmamembran lokalisiert war, die wiederum mit dem Schweregrad der Brachydaktylie korrelierten. Die neue Mutation zeigte ein intermediäres Verhalten, wobei im heterozygoten Zustand die Menge des mutanten Protein an der Zellmembran nicht ausreicht, um eine dominante BDB1 hervorzurufen. Im homozygoten Zustand führt sie jedoch zu einer schweren Brachydaktylie mit RRS Merkmalen. Dieses graduelle Modell wurde durch Kreuzungen der Mausmodelle für BDB1 und RRS bestätigt, wobei doppelt heterozygote Tiere ebenfalls einen intermediären Phänotyp aufwiesen. Im Falle der Daktylaplasie-Maus (Dac), dem Modell der humanen Spalthand und -Fuß Malformation 3 (SHFM3), wird der Phänotyp durch einen zweiten Lokus im gentischen Hintergrund von Inzuchtmausstämmen determiniert. Der sogenannte "modifier of dactylaplasia" (Mdac) unterdrückt den Ektrodaktylie-Phänotyp der Dac-Mutation vollständig, falls das dominante Allele vorliegt. Das genetische Intervall, welches bekannt ist Mdac zu enthalten, wurde durch klassische Kopplungsanalyse und durch in silico-Kartierung eingeschränkt. Dadurch konnte eine schlüssige Hypothese über die Identität und Wirkungsweise von Mdac entwickelt werden. Bis heute sind die molekularen Mechanismen der Mutationen, die Daktylaplasie und SHFM3 verursachen, ungeklärt. Die sorgfältigen Analysen in dieser Arbeit bestätigen die Annahme, dass vermehrte Apoptose zu dem Verlust der mittleren apikalen ektodermalen Randleiste (AER) und somit zu dem Ektrodaktylie-Phänotyp führt. Dieses wird vermutlich durch eine Reduzierung des kanonischen Wnt-Signalwegs verursacht, welche durch die verringerten Mengen von Lef1-Transkripten und β-Catenin Proteins angedeutet wird. Allerdings konnte die direkte molekulare Ursache für diese Misregulation bislang nicht geklärt werden. Daher wurde ein Protokoll zur sauberen Präparierung der AER entwickelt. Durch Expressionsanalysen von diesem Gewebe zu verschiedenen Zeitpunkten kann die initiale Deregulation ermittelt werden.