Studies on membrane protein folding by surface enhanced infrared absorption spectroscopy

Abstract

The correct folding and assembly of membrane proteins in biological membranes are preconditions for correct protein function and thus activity of a living cell. Not much is known about the fundamental principles of membrane protein folding under native conditions due to the diffculties to study such complex systems in vivo and in operando. Most existing studies investigate folding by unfolding/refolding a unctional protein in vitro. In this thesis, for the first time insertion and folding of a nascent membrane protein into a lipid bilayer was monitored during native protein biosynthesis. Therefore, SEIRAS, cell-free protein expression and nanodiscs were combined in a novel manner, which allowed the label-free and non-invasive investigation of insertion and folding of the retinal protein bR, a 7-alpha-helical transmembrane proton pump from H. salinarum. Protein synthesis was performed in an optical cell containing a prism covered with a thin gold film. with nanodiscs on top, providing an biomimetic lipid bilayer for folding. Thereby, the folding was visualized by the transition of the nascent polypeptide chain from less ordered structure elements via secondary towards tertiary structure during co- translational bilayer insertion. In first experiments, the impact of the co- factor retinal on folding was probed and revealed its importance for folding speed and the structure formation process. Furthermore, by folding experiments on other alpha-helical proteins (Halobacterium salinarum sensory rhodopsin I, Halobacterium salinarum sensory rhodopsin II and the transmembrane region of Chlamydomonas rheinhardtii channel rhodopsin 2) the transferability of the technique was demonstrated. Hence, the here described methodology represents a valuable approach to study membrane protein folding in situ and in operando on a molecular level to enlarge our understanding on fundamental folding principles.

Die richtige Faltung und Anordnung eines Membranproteins in seiner biologischen Membran ist Grundvoraussetzung für dessen Funktion und damit entsprechend der Zellaktivität. Das bisherige Verständnis über Membranproteinfaltung stützt sich auf Ergebnisse von Studien, die das Entfaltungs- und Rückfaltungsverhalten eines funktionalen Membranproteins untersuchen. Hingegen wenig ist bekannt über Faltung unter den natürlichen Bedingungen einer Proteinbiosynthese, maÿgeblich aufgrund der auÿerordlichen Schwierigkeit derartig komplexe Systeme in vivo und in operando untersuchen zu können. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmalig Faltungsereignisse eines Membranproteins bei Insertion in eine Lipiddoppelschicht unter naturnahen Bedingungen. Dafür wurden oberfächenverstärkte Infrarotabsorptionsspektroskopie (SEIRAS), zellfreie Proteinexpression und Nanodiscs in einer neuartigen Weise kombiniert, sodass die Insertion und Faltung des Retinalproteins Bakteriorhodopsin (bR) (eine 7-alpha-helikale transmembrane Protonenpumpe von Halobacterium salinarum), nichtinvasiv und ohne Modifkationen durch Markermoleküle, untersucht werden konnten. Die Proteinsynthese wurde dabei auf der Oberfläche einer optischen Zelle durchgeführt, die zuvor mit einem dünnen Goldfilm und einer Nanodiscmonolage beschichtet worden war. Die Nanodiscs stellten dabei die biomimetische Lipiddoppelschicht zur Faltung des Membranproteins dar. Es konnte ein Übergang von eher ungeordneten Proteinstrukturen über Sekundärstrukturen bis hin zur Tertiärstrukturbildung beobachtet werden, wodurch der Faltungsweg des Membranproteins sichtbar gemacht werden konnte, während es kotranslational in die Membran eingebaut wurde. Erste Experimente mit dem Kofaktor Retinal zeigten dessen wichtigen Einfluss auf den Faltungsprozess, Faltungsgeschwindigkeit und Strukturformation. Weitere Faltungsexperimente anderer alpha-helikaler Membranproteine (Halobakterium salinarum Sensorisches Rhodopsin I, Halobakterium salinarum Sensorisches Rhodopsin II und der Transmembranbereich von Chlamydomonas rheinhardtii Kanalrhodopsin 2) konnten die Übertragbarkeit der Technik demonstrieren. Die hier beschriebene Methodik stellt einen wertvollen Untersuchungsansatz zur Membranproteinfaltung in situ und in operando auf molekularer Ebene dar und birgt großes Potential das bisherige Verständnis über fundamentale Faltungsprinzipien zu bereichern.