Untersuchung der pharmakologischen Wirkung einer direkten Angiotensin AT2 Rezeptor Stimulation mittels Genexpressionsanalyse auf hypertoniebedingte Organschäden in einem L-NAME Hypertoniemodell bei Ratten

Abstract

Angiotensin II-Rezeptor-Subtyp 2 (AT2R) Stimulation durch den ersten selektiven nicht-peptidischen Agonisten Compound 21 (C21) beugt partiell den Folgen einer L-NAME (Nω-nitro-Larginine-methylester) induzierten Hypertonie in Ratten vor, ohne den Blutdruck zu beeinflussen. Untersucht wurde die Wirkung von AT2R-Stimulation auf das Remodeling von Herz und Aorta anhand der mRNA- Expression ausgewählter Gene bei L-NAME induzierter Hypertonie. Von Interesse waren Gene, die den Inflammationsstatus widerspiegeln (IL 1, IL 2, IL 6, IL 10, TGFB 1, COX 1, COX 2, iNOS, eNOS), Bildung und Abbau der extrazellulären Matrix regulieren (COL1 A1, COL3 A1, MMP 1, MMP 2, MMP 9, MMP 13, TIMP 1), bei der Apoptose aktiviert sind (BAX, BCL 2, CASP 3, CASP 9, und die mRNA- Expression beider AT-Rezeptor Subtypen, AT1R und AT2R, sowie des natriuretic peptide B (BNP). METHODIK Gewebeproben waren von Ratten gewonnen worden, die Vehikel behandelt, oder mit L-NAME hypertonisiert, oder zugleich mit C21, oder dem AT1R-Blocker Olmesartan (OLME), oder beiden behandelt worden waren. Die Analyse der mRNA-Expression erfolgte mittels quantitativer Polymerasekettenreaktion anhand der Fluoreszenz mit SYBR™ green und TaqMan®-Sonden. Die statistische Auswertung wurde als Rank-Summenanalyse mit nachfolgenden paarweisen Vergleichen durchgeführt. ERGEBNISSE Auf mRNA-Ebene konnte eine Expression von AT1R und AT2R in Herz- und Aortagewebe gezeigt werden, die durch AT1R-Blockade oder AT2R-Stimulation nicht beeinflussbar war. Die mRNA-Expression von BNP im Herzgewebe war unter L-NAME erhöht, unter Zusatz von C21, OLME und deren Kombination aber auf Kontrolltierniveau reguliert. Die relativ zu Kontrolltieren numerisch erhöhte IL 6 und TGFB 1 mRNA-Expression unter LNAME in Aortagewebe war unter Zusatz von C21, OLME und deren Kombination numerisch geringer; unter der Kombination war die Expression von IL 6 statistisch signifikant geringer als unter L-NAME allein. Unter der Kombinationstherapie war die Kollagenisierung der Aorta stärker gehemmt und die mRNA-Expression von MMP 2 stärker als unter C21 und OLME allein, ohne dass dies jedoch mit einer Regulierung der mRNA-Expression von COL1 A1, COL3 A1 oder TIMP 1 verbunden war, während im Herzgewebe dagegen die mRNA-Expression von COL1 A1, COL1 A3 und TIMP 1 erhöht war. Im Herzgewebe war die mRNA- Expression des Apoptosemarkers CASP 3 unter L-NAME am geringsten, unter der Kombinationsbehandlung aber erhöht, und im Aortagewebe behandlungsunabhängig. SCHLUSSFOLGERUNG Die Ergebnisse sprechen für eine unterschiedliche Regulation des RAAS-assoziierten Remodeling in Herz- und Aortagewebe. Unter Berücksichtigung versuchsbedingter Einschränkungen unterstützen die mRNAExpressionsbefunde die These, dass die Folgen einer L-NAME induzierten Hypertonie auf das Herz-Remodeling blutdruckunabhängig durch die durch AT2R- Stimulation mit Compound 21 induzierten anti-inflammatorischen und pro- apoptotischen Wirkungen teilweise abgeschwächt werden.

Stimulation of the angiotensin II-receptor subtype 2 (AT2R) with the first selective non-peptidic agonist Compound 21 (C21) partially prevents effects of L-NAME (Nω-nitro-L-arginine-methylester) induced hypertension in rats without affecting blood pressure. Aim of this study was to substantiate the effects of AT2R-stimulation on cardiac and aortic remodeling by investigating the mRNA- expression of selected genes in L-NAME induced hypertension. The focus was on genes reflecting inflammation (IL 1, IL 2, IL 6, IL 10, TGFB 1, COX 1, COX 2, iNOS, eNOS), production and degradation of extracellular matrix (COL1 A1, COL3 A1, MMP 1, MMP 2, MMP 9, MMP 13, TIMP 1) and apoptosis (BAX, BCL 2, CASP 3, CASP 9). The expression of AT-receptor subtypes, AT1R and AT2R, and natriuretic peptide B (BNP) was also studied. METHODS Tissue samples were gained from rats which have either been vehicle-treated, or with L-NAME only, or concomitantly with the AT2R-agonist C21, the AT1R-blocker Olmesartan (OLME), or both. Analysis of mRNA-expression was performed by quantitative polymerase chain reaction via fluorescence with both SYBR™ green and TaqMan®-probes. Rank-sum analysis with post-hoc pairwise comparison was used for statistical analysis. RESULTS Both AT1R- and AT2R-mRNA were expressed in heart and aorta, although this was not modified by AT1R-blockade or AT2R- stimulation. Increased BNP-mRNA levels in hearts from hypertensive L-NAME animals were downregulated to control levels by treatment with C21 and OLME alone or combined. In aortic tissue, mRNA-expressions of pro-inflammatory genes IL 6 and TGFB 1 were numerically higher in the L-NAME group as compared to controls and were lower on C21 and OLME treatment, which combined significantly decreased IL 6 mRNA-expression compared to the LNAME group. In aorta, treatment with C21 and OLME alone, and more prominent combined, prevented an increase in collagen content. This was associated with increased MMP 2 mRNA-expression, while genes COL1 A1, COL1 A3 and TIMP 1 were not regulated. In cardiac tissue, in contrast, mRNA-expression of these genes was elevated under combined therapy. mRNA-expression of an apoptotic marker, CASP 3, was lower in L-NAME samples of heart but up-regulated under the combination, while it was not altered in aortic samples. CONCLUSION The results suggest different gene regulation of RAAS associated remodeling in heart and aorta. Considering study related limitations, the results on mRNA- expression support the thesis that consequences of L-NAME induced hypertension on the heart remodeling can partially be alleviated by selective AT2R stimulation with C21 through anti-inflammatory and pro-apoptotic effects, without impacting blood pressure.