Die Protein Kinase C als Bindeglied von Ionenkanalmodulation und Interferon Signalweg: über den Protein Kinase C vermittelten Einfluss auf die überschwellige Erregbarkeit und den hyperpolarisationsaktivierten unselektiven Kationenstrom (Ih)

Abstract

Das Immun- und Nervensystem stehen in gegenseitiger Kommunikation. So wurde schon früh ein Zusammenhang zwischen Stress und einem geschwächten Immunsystem gefunden. Dass dieser Weg auch in entgegen gesetzter Richtung möglich ist, also die Beeinflussung des Nervensystems durch das Immunsystem, wurde bereits für Interleukine, die zur Gruppe der Cytokine gehören, gezeigt. Das, in meinem Fokus stehende, Typ I Interferon (IFN) gehört zur Gruppe der Cytokine und besitzt immunmodulatorische und antivirale Eigenschaften. Typ I IFN aktiviert über seinen Rezeptor verschiedene Signalwege, die in den klassischen Signalweg und in alternative Signalwege unterteilt werden. Da Typ I IFN auch direkt von Neuronen gebildet wird, lag die Vermutung nah, dass es neuromodulatorische Eigenschaften besitzt. Die Hinweise auf eine Typ I IFN induzierte Beeinflussung des hyperpolarisationsaktivierten unselektiven Kationenstroms (Ih) und dessen Einfluss auf die neuronalen Erregbarkeit, stellten die Basis meiner Arbeit dar. Der Ih ist beim Ruhemembranpotential (RMP) von Neuronen partiell aktiviert und spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle neuronaler Informationsverarbeitung. Aufgrund seiner Eigenschaften gilt er als einer der bestimmenden Faktoren der neuronalen Erregbarkeit. Ih wird über hyperpolarisationsaktivierte, von cyclischen Nukleotiden modulierte (HCN)-Kanäle geleitet. Diese werden von vier Untereinheiten (HCN1-4) gebildet und liegen als Homo- oder Heterotetramere im Gehirn vor. In den verschiedenen Arealen des Gehirns ist ihre Expression unterschiedlich stark ausgeprägt. In den von uns untersuchten neocortikalen Pyramidenzellen der Schicht 5 wird der Ih durch die Untereinheiten HCN1 und HCN2 vermittelt. HCN Kanäle werden durch verschiedene Modulatoren beeinflusst. Im Fokus meiner Arbeit steht seine Modulation durch Protein Kinase C (PKC), die auch bei alternativen Typ I IFN- Rezeptorsignalwegen eine Rolle spielt. Die Arbeit klärt die Modulation der unter- und überschwelligen neuronale Erregbarkeit durch das Typ I IFN IFN-β und PKC. PKC dient hypothetisch als Bindeglied zwischen IFN-Signalweg und multiplen neuronalen Ionenkanälen. Mein Fokus liegt auf den im Neocortex Ih mediierenden HCN Kanälen. Unsere Befunde basieren auf elektrophysiologischen ex vivo Messungen an neocortikalen Pyramidenzellen der Schicht 5 in Hirnschnitten von Maus- bzw. Ratten im whole cell Modus oder in vitro im Kulturmodell an Säugerzellen im whole cell und cell attached Modus mittels pharmakologischer Aktivierung oder Inhibition der neuronalen Typ I IFN Effekte. Zusätzlich nahmen wir in vivo Virusinfektionen vor oder analysierten das Maus- bzw. Rattengehirn elektroenzophalografische (EEG) nach direkter IFN-β Applikation. Alle Messungen erfolgten bei Typ I IFN Konzentrationen mit pathophysiologischer Relevanz. Die Wirkung verschiedener einzelner und kombinierter Ionenkanalmodulationen überprüften wir anhand eines in silico Computermodells. Des Weiteren untersuchten wir mittels Western blot und Immunohistochemie das Vorhandensein des Typ I IFN Rezeptors und die Aktivierung einiger seiner Signalwegsbestandteile. So konnten wir zeigen, dass Typ I IFN sowohl über eine virale Infektion als auch über die direkte Applikation den Ih reduziert und dass der Typ I IFN Effekt auf den Ih HCN1 spezifisch ist. Voraussetzung dafür ist ein intakter Typ I IFN- Rezeptorsignalweg. Für alternative Typ I IFN-Rezeptorsignalwege spielt PKC eine wichtige Rolle. Für PKC konnte von uns gezeigt werden, dass sie den HCN1 Kanal moduliert. Im Kulturmodell ist für den PKC mediierten Effekt auf den HCN1 Kanal eine intakte intrazelluläre Umgebung notwendig. Dabei wird der Ih durch die Aktivierung von PKC auf 60-70 % reduziert, wohingegen die vorherige Inhibition von PKC eine solche Reduktion verhindert. Nahezu gleiche Effektgrößen bei unterschiedlichen Säugerzellen-Kulturmodellen machen eine Speziesspezifität unwahrscheinlich. Eine Beeinflussbarkeit durch PKC ist den im in silico Modell modulierten Strömen gemein, die für die Nachahmung des ex vivo IFN Effekts auf die neuronale Erregbarkeit notwendig waren. Wodurch wir PKC als Verbindung zwischen Typ I IFN Signalkaskade und Ionenkanalmodulation schlussfolgern. In gleicher Weise verursachte eine PKC Aktivierung oder eine IFN-β Applikation in neocortikalen Pyramidenzellen der Schicht 5 eine Erhöhung der neuronalen Erregbarkeit. Dabei blieb jeweils die Aktionspotentialschwelle unverändert. Zusätzlich beobachteten wir eine reduzierte Nachhyperpolarisation (AHP) nach PKC Aktivierung wie auch nach Applikation von IFN-β. Übereinstimmend mit unseren Erkenntnissen reduziert eine IFN-β Applikation den M-Typ Kalium Strom (IM), der an der AHP beteiligt ist. Eine vorherige Inhibierung der PKC verhinderte die Wirkung von IFN-β auf die Erregbarkeit. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse, dass IFN-β unter pathophysiologischen Bedingungen als Neuromodulator wirkt und zeigen erstmals dass diese Funktion durch PKC vermittelt wird. Dabei haben wir gezeigt, dass multiple Ionenkanäle, wie der HCN1 oder M-Typ Kalium Kanal, ihrer Wirkung unterliegen. Für die Vermittlung des Typ I IFN Effekts ist die PKC Aktivierung hinreichend und notwendig. Dadurch werden die Typ I IFN Signalkaskade und die Ionenkanäle miteinander verbunden. Daher sehen wir die Aktivierung von PKC als einheitlichen Mechanismus für das neuromodulatorische Potential von Typ I IFN in neocortikalen Neuronen an. Dadurch ist der Grundstein für eine Regulation neuronaler Antworten während einer Entzündung des zentralen Nervensystems gelegt. IFN-β konnte ebenfalls im gesunden ZNS nachgewiesen werden, was für IFN-β auch eine Rolle in der physiologischen Neuromodulation impliziert. Somit könnte die Neuromodulation durch IFN-β neben ihrer pathophysiologischen Relevanz auch unter physiologischen Bedingungen von großer Wichtigkeit sein.

The immune and nervous system appear to communicate with each other. Early research uncovered that nervous structures influence the immune system, i. e. stress weakens the immune system. Further the immune system affects the nervous system for instance via interleukins, a class of cytokines. Here I focused on the cytokine type I Interferon (IFN) that has immunomodulatory and antiviral properties. It activates via its receptor different signal pathways, which were separated in the classical pathway and several alternative pathways. Because type I IFN is also directly produced by neurons, we assume additional neuromodulatory properties. Implications of a type I IFN induced influence on hyperpolarization-activated nonselective cation current (Ih) and its influence on neuronal excitability were the basis of my work. Ih is partially activated at resting membrane potential (RMP) of neurons and has an important role in the control of neuronal information processing. Because of its properties it is considered as one of the determinants of neuronal excitability. Ih is mediated by hyperpolarization-activated cyclic nucleotide- gated (HCN) channels, which are formed by 4 subunits (HCN1-4) and assembled as homo- or heterotetrameric complexes. Their expression pattern differs depending on the brain area. In neocortical layer 5 pyramidal neurons, which we used for our studies, Ih is mediated by HCN1 and HCN2 subunits. Different modulators influence the properties of HCN channels. I focused on its modulation via protein kinase C (PKC) that plays an important role in alternative IFN signaling pathways. This work clarifies the type I IFN, IFN-β and PKC mediated modulations of the sub- and suprathreshold neuronal excitability. Hypothetically, PKC links IFN signaling pathway and multiple neuronal ion channels. I focused on the Ih mediating HCN channels in the neocortex. Our findings are based on electrophysiological ex vivo whole cell recordings in neocortical layer 5 pyramidal neurons of mouse and rat brain as well as in vitro whole cell and cell attached recordings in mammalian cell culture systems with pharmacological activation or inhibition of the neuronal IFN effects. Additionally we elevated intracerebral type I IFNs by in vivo virus infection or analyzed mouse and rat brains activity via electroencephalography (EEG) after direct IFN application. We performed all measurements with pathophysiological relevant IFN concentrations. We tested the effect of different single and combined ion channel modulations in an in silico computer model. Furthermore we analyzed the presence of type I IFN receptors in neocortical layer 5 pyramidal neurons via immunohistochemistry and the activation of some components of its pathway via Western blotting. Therewith we could show that type I IFN reduced the Ih after virus infection and after a direct type I IFN application and that this type I IFN effect is HCN1 specific. Type I IFN effects depend on an intact type I IFN receptor signaling pathway. For alternative type I IFN receptor signaling pathways PKC plays an important role. Our findings demonstrate that PKC modulates HCN1 channels. For PKC mediated effects on HCN1 channels an intact intracellular environment of the cultured cells is necessary. PKC activation reduced Ih to 60-70 %, whereas a prior inhibition of the PKC prevents the PKC dependent Ih reduction. Because of similar magnitude of effects in different mammalian cell systems species specificity is unlikely. All currents necessary for mimicking the ex vivo IFN effects on neuronal excitability in silico are modulated by PKC. Therefore we reasoned that PKC links the type I IFN signaling cascade and ion channel modulations. An activation of PKC or an IFN-β application in neocortical layer 5 pyramidal neurons increased the neuronal excitability in the same manner. However, the threshold of the action potential remained constant. Additionally, after PKC activation or IFN-β application we observed a reduced after-hyperpolarisation (AHP). Consistent with our findings, we also observed a reduced M-type potassium current (IM) after IFN-β application. Prior inhibition of PKC prevents the type I IFN effects on neuronal excitability. In summary, these findings confirm the neuromodulatory effect of IFN-β under pathophysiological conditions and show for the first time that this effect is PKC mediated. Accordingly we could show that multiple ion channels, such as HCN1 or M-type potassium channel underlie this effect. For mediating the type I IFN effect, PKC activation is both sufficient and necessary and links IFN signaling cascade and ion channels. Therefore we propose PKC activation as unitary mechanism for the neuromodulatory potential of type I IFN in neocortical neurons. This represents the basis for regulation of neuronal response during an inflammation of the central nervous system (CNS). IFN-β was also detected in a healthy CNS implying a role in the physiological neuromodulation. Because of that neuromodulation via IFN-β may not only be pathophysiologically relevant, but also important under physiological conditions.