dc.contributor.author
Denner, Philip
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:31:51Z
dc.date.available
2007-01-11T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1210
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-5412
dc.description
1\. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
2\. Einleitung
3\. Material und Methoden
4\. Ergebnisse
5\. Diskussion und Ausblick
6\. Zusammenfassung & Summary
7\. Literaturverzeichnis
8\. Anhang
9\. Danksagung
dc.description.abstract
In dieser Arbeit wird erstmalig eine noch unbekannte zellzyklusabhängige
Phosphorylierung des zytostatischen CDK-Inhibitors p21 vorgestellt. p21 wird
hierbei zu Beginn der Mitose im Zellkern am Thr-145 phosphoryliert. Es
konzentriert sich im weiteren Verlauf der Mitose in spezifischen
Kompartimenten der sich teilenden Zelle. Nach anfänglicher, diffuser
Verteilung innerhalb des Zellkerns (Prophase) ist es im weiteren Prozess der
Mitose ausschließlich an den Spindelpolen (Prometa- und Metaphase), später
jedoch nur noch an der Teilungsfurche (Telophase) und im Bereich des
kontraktilen Ringes (Zytokinese) zu detektieren. In eukaryotischen Zellen
während der Interphase ist p21 nicht phosphoryliert. Die spezifische,
zeitabhängige Lokalisation an den Spindelpolen und später im Bereich des
kontraktilen Rings lassen auf verschiedene Funktionen schließen, die
p-p21-Thr145 im Prozess der Mitose erfüllt. Bisherige Arbeiten beschreiben die
induzierte Phosphorylierung von p21 am Thr-145 nach Substanzbehandlung oder
Proteintransfektion in der G1-, S- und G2-Phase des Zellzyklus. Hierbei konnte
eine proliferative und anti-apoptotische Wirkung nachgewiesen werden. Aufgrund
der vorliegenden Daten muss also zwischen der zellzyklusabhängigen
Phosphorylierung von p21 in der Mitose und der induzierten Phosphorylierung
während der Interphase unterschieden werden. Die induzierte Phosphorylierung
kann durch Fehlregulationen von Kinasen verursacht werden, deren
Überexpression in verschiedenen Tumorarten festgestellt wurde. Zu diesen
Kinasen gehört Pim-1. Um die Interaktion zwischen Pim-1 und p21 in lebenden
Zellen zu untersuchen, wurden beide mit autofluoreszierenden Proteinen
markiert. Zunächst wurden die p21- und Pim-1-spezifischen Funktionen der
Fusionsproteine in biochemischen und zellbasierten Experimenten überprüft. In
anschließenden Transfektionsstudien konnte die Phosphorylierung von endogenem
p21 durch Pim-1-WT-GFP im Zellkern eukaryotischer Zellen festgestellt werden.
Die Phosphorylierung von endogenem p21 durch Pim-1-WT-GFP führte zudem zu
einer Translokation von p-p21-Thr145 in das Zytosol. Hier kann es an den
Mitochondrien mit Procaspase-3 interagieren und so den Fas-vermittelten
Apoptoseweg inhibieren. Die induzierte, unkontrollierte Phosphorylierung des
zytostatischen Zellzyklusinhibitors p21 durch erhöhte Pim-1-Enzymaktivität,
kann so eine proliferative und anti-apoptotische Wirkung auf die Zelle haben
und deren unkontrolliertes Wachstum fördern. Zusätzlich wird in der
vorliegenden Studie ein neu entwickelter funktioneller HCA-Assay vorgestellt,
mit dem anhand der Thr-145-Phosphorylierung von endogenem p21 durch Pim-1-WT-
GFP potentielle Pim-1-Inhibitoren in lebenden Zellen analysiert werden können.
Die Phosphorylierung von p21 wurde hierbei als Maß der Pim-1-WT-GFP-
Enzymaktivität und reziprok für die Wirksamkeit eines potentiellen Inhibitors
unter zellulären Bedingungen verwendet.
de
dc.description.abstract
The protein p21 is involved in several regulating processes during the G1, S
and G2 phase of the cell cycle. In the present study, we demonstrated that p21
is also involved in the process of mitosis. At the onset of mitosis, p21 is
phosphorylated at Thr-145 and accumulates at the spindle poles where it
remains until chromosomes segregation occurs. At the beginning of cytokinesis,
phosphorylated p21 shuttles from the centrosomes to the cleavage furrow and
seems to be associated with the contractile ring until the end of mitosis. The
localization of p-p21-Thr145 within specific compartments during mitosis
transition implies its participation in functional processes where at first
the centrosomes and later the contractile ring are involved in. Previous
publications described an induced phosphorylation of p21 at Thr145 after cell
treatment during the interphase of the cell cycle. This phosphorylation
inhibited the cytostatic properties of p21 in these cells and caused
proliferative and anti-apoptotic effects. For that reason, it is important to
distinguish between the cell cycle dependent phosphorylation of p21 during
mitosis progression and the induced phosphorylation during the interphase of
the cell cycle. The induced phosphorylation can be a result of dysregulated
kinases which are upregulated in several types of cancer. Pim-1 is one of
these tumor related kinases. Pim-1 and p21 were attached to autofluorescent
proteins to study their interactions in living cells. The proper functions of
the fusion proteins were proved in biochemical and cell based assays. This
study demonstrates that increased expression of Pim-1-WT-GFP leads to the
phosphorylation of endogenous p21 within the nucleus. Additionally,
p-p21-Thr145 was also detected within the cytosol in a subpopulation of these
cells. Here it can interact with procaspase-3 or ASK1, preventing the
induction of apoptosis. The induced phosphorylation as a result of increased
Pim-1 enzyme activity can lead to proliferative and anti apoptotic effects,
both of which can actively contribute to tumorigenesis. Furthermore, the Pim-1
-WT-GFP dependent phosphorylation of endogenous p21 was used to analyse the
effect of potential Pim-1 inhibitors under cellular conditions in a new
functional HCA assay. The intracellular phosphorylation of p21 was used as a
read out parameter for the Pim-1 enzyme activity and for the effect of the
potential Pim-1 inhibitors, respectively.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
phosphorylation
dc.subject
High Content Anaylsis
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Mechanistische Analysen zur zellzyklusabhängigen und induzierten
Phosphorylierung von p21 in eukaryotischen Zellen
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Dietmar Kuhl
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Martin Schneider
dc.date.accepted
2006-12-19
dc.date.embargoEnd
2007-01-26
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000002662-4
dc.title.translated
Cell cycle-dependent and induced phosphorylation of p21 in eukaryotic cells
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
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FUDISS_thesis_000000002662
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