Entwicklung von primären Referenzverfahren zur Quantifizierung und Bestimmung des Beladungsgrades von Transferrin

Abstract

Transferrin (Tf) als Akute-Phase-Protein ist ein wichtiger diagnostischer Marker für entzündliche Prozesse im menschlichen Körper. Deshalb wurde es auch in der „Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen“ (RiLiBÄK) in die Liste wichtiger Analyte aufgenommen. Klinisch-chemische Laboratorien sind daher dazu verpflichtet, regelmäßig in Ringversuchen nachzuweisen, dass sie die Tf- Konzentration in den von der RiLiBÄK vorgegeben Grenzen verlässlich bestimmen können. Von der Bundesärztekammer wird eine Rückführung auf das SI-System dieser Messergebnisse angestrebt, da nur auf diese Weise ein bundes- bzw. weltweiter Vergleich möglich ist. Der Physikalisch-Technischen Bundesanstalt (PTB) fällt dabei die Aufgabe zu, die Voraussetzung für die Rückführung zu schaffen, indem sie ein an das SI-System angeschlossenes Weitergabesystem aufbaut. Dafür ist es notwendig, eine Referenzmethode zu entwickeln und bereitzustellen, die es ermöglicht Tf mit einer Unsicherheit zu bestimmen, die deutlich unter der in der RiLiBÄK geforderten Unsicherheit liegt. Vor diesem Hintergrund sowie dem weiteren Ziel den Tf-Gehalt in Referenzmaterialien rückgeführt bestimmen zu können, wurden im Rahmen dieser Arbeit primäre Referenzverfahren zur Quantifizierung und Bestimmung des Fe-Beladungsgrades von Tf entwickelt. Die Quantifizierung erfolgte über eine chromatographische Trennung des Tf von der Serummatrix mit HPLC und anschließender elementspezifischer Detektion des in dem Tf gebundenen Fe mit ICP-MS. Zur Quantifizierung wurde sowohl post column (PC) als auch spezies spezifische (SS) Isotopenverdünnungsmassenspektrometrie (IDMS) eingesetzt. Beide Verfahren wurden als double IDMS unter Verwendung des Exakt Matching Prinzips angewandt. Außerdem fand zum ersten Mal in der Speziesanalytik die triple IDMS Anwendung. Alle Methoden ergaben für das humane Serum ERM-DA470k/IFCC vergleichbare Tf- Gehalte von wx = (2,36 ± 0,13) g/kg für PC-IDMS, wx = (2,317 ± 0,092) g/kg für double SS-IDMS und wx = (2,426 ± 0,086) g/kg für triple SS-IDMS, die gut mit dem zertifizierten, über herkömmliche Methoden bestimmten Wert von wx = (2,41 ± 0,08) g/kg übereinstimmen. Da der Fe-Beladungsgrad von Tf wichtige Rückschlüsse auf die Fe-Versorgung eines Patienten zulässt, wurde dieser ebenfalls mit IDMS bestimmt. Zusätzlich wurde erstmals auch eine Raman-Methode zur Bestimmung der Fe-Beladung entwickelt. Die Methoden, angewandt auf ein gefriergetrocknetes nat. Tf, ergaben auch hier vergleichbare Werte: b = (30,20 ± 1,20) % mit IDMS und b = (28,2 ± 2,0) % mit Raman. Alle Ansätze wurden, wie in der Metrologie üblich, gravimetrisch angesetzt und erweiterte Unsicherheiten (k = 2) entsprechend der Vorgabe des Bureau International des Poids et Mesures (BIPM) in “Evaluation of measurement data — Guide to the expression of uncertainty in measurement” (GUM) berechnet.

Transferrin (Tf), as an acute phase protein, is an important diagnostic marker for inflammation processes in the human body. Therefore, it was included in the List of important analytes in the guidelines of the German Medical Association (RiLiBÄK). Hence, clinical chemical laboratories are bound to participate in interlaboratory comparisons periodically to guarantee their ability to determine Tf within the limits defined in the RiLiBÄK. The German Medical Association aspires the traceability to the SI of those measurement results, because this is the only reliable way to ensure comparability nationwide as well as globally. The Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB) is responsible for establishing traceability. This requires a traceability chain, which is connected to the SI, and a reference method which uncertainty is significantly lower than the uncertainty required in RiLiBÄK. Considering this as well as the goal to achieve traceable results for the content of Tf in reference materials, primary reference methods were developed in this work to quantify the content and to determine the iron saturation of human Tf. For the quantification, Tf was chromatographically separated from the serum matrix with HPLC and subsequently measured with element mass spectrometry (ICP-MS) via the Fe bound to Tf. Post column (PC) and species specific (SS) isotope dilution mass spectrometry (IDMS) were used. Both, PC- and SS-IDMS, were performed as double IDMS using the exact matching principle. Furthermore, triple IDMS was used for the first time in species analysis. All methods were applied to the human serum reference material ERM-DA470k/IFCC and comparable results for the content of Tf were achieved with wx = (2.36 ± 0.13) g/kg for PC-IDMS, wx = (2.317 ± 0.092) g/kg for double SS-IDMS and wx = (2.426 ± 0.086) g/kg for triple IDMS. These results were in good agreement with the value given in the certificate of wx = (2.41 ± 0.08) g/kg which was determined with conventional methods. The iron saturation of Tf allows important conclusions on the Fe supply of patients. Therefore, it was also determined with IDMS and additionally a Raman procedure was developed the first time. The methods were adopted to a freeze dried natural Tf and also achieved comparable results: b = (30.20 ± 1.20) % for IDMS and b = (28.2 ± 2.0) % for Raman. All necessary solutions were produced gravimetrically and the expanded uncertainties (k = 2) of the results were calculated according to the recommendations of the Bureau International des Poids et Mesures (BIPM) in “Evaluation of measurement data — Guide to the expression of uncertainty in measurement” (GUM).