Cytokine-mediated expression of catabolic & pro-inflammatory mediators in synovial fibroblasts with regard to the pathogenesis of osteoarthritis

Abstract

Background: The synovial membrane (SM) is part of every diarthrosis and potential hub in the pathogenesis of osteoarthritis (OA). Pro-inflammatory cytokines, e.g. tumor necrosis factor α (TNFα), which are detectable in osteoarthritic joints, might induce the synthesis of pro-inflammatory and catabolic mediators, e.g. interleukin 6 (IL-6), in synovial fibroblasts (SF), leading to a vicious circle that could accelerate cartilage degradation and chondrocyte apoptosis. The effects of intra-articular cytokines on SF are not completely understood. Hence, it was the aim of this dissertation to characterize the interplay between TNFα and the anti-inflammatory IL-10 in SF to decide whether IL-10 might modulate or block its catabolic effects. Methods: Primary human SF were isolated from knee joints of OA-affected donors, cultured, expanded and stimulated with TNFα, IL-10 or TNFα + IL-10 for 24 h. Gene expression of IL-6, IL-10, matrix metalloproteinases-1 & -3 (MMP-1; MMP-3) was investigated via RTD-PCR. Protein synthesis of the same mediators as well as type I collagen, CD44 and β_1 integrin was de-termined using flow cytometry (FC), immunofluorescence labeling (IF) and western blot (WB). IL-10 adenoviral transduction was performed to simulate a possible OA treatment. The transduction effects were measured using RTD-PCR and investigation of IL-10 protein secretion via an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Finally, the permanent K4IM cell line was established as a possible substitute for cultured human SF in future experiments. Results: Cultured SF were activated by TNFα and TNFα + IL-10, increasing their gene expression of IL-6, IL-10, MMP-1 & -3. Investigation of the protein synthesis via IF showed results consistent with RTD-PCR, while FC revealed distinct differences. WB demonstrated varied stimulation effects on the synthesis of extracellular matrix proteins and matrix receptors. The adenoviral transduction was successful. The gene expression of IL-10 was greatly elevated. Effects on the gene expression of IL-6, MMP-1 and MMP-3 were statistically not significant. Reactions in the K4IM cell line were largely congruent with those observed in cultured human SF. Conclusion: Human SF in culture are strongly activated by TNFα and TNFα + IL-10, increasing the gene expression and protein synthesis of pro-inflammatory and catabolic mediators. These findings illuminate the role of SF in the pathogenesis of OA, suggesting them as a potential future therapeutic target, even though IL-10 overexpression alone appears to be insufficient for an effective OA therapy. The K4IM cell line could be a suitable substitute for cultured human SF in future stimulation experiments.

Hintergrund: Die Synovialmembran (SM) ist Bestandteil jeder Diarthrose und potentieller Knotenpunkt in der Arthrose-Pathogenese. Pro-inflammatorische Zytokine, insbesondere Tumornekrosefaktor α (TNFα), die in arthrotischen Gelenken in erhöhter Konzentration nachweisbar sind, könnten die Synthese zusätzlicher pro-inflammatorischer und kataboler Mediatoren, z.B. Interleukin 6 (IL-6), in Synovialfibroblasten (SF) induzieren und zu einem Teufelskreis führen, der die Knorpelschädigung und Chondrozytenapoptose beschleunigt. Die Wirkungen intra-artikulärer Zytokine auf SF wurden noch nicht vollständig verstanden. Daher war es Ziel dieser Dissertation das Wechselspiel zwischen TNFα und IL-10 in SF zu charakterisieren und zu entscheiden, ob IL-10 dessen katabole Effekte modulieren bzw. blockieren kann. Methoden: Aus Kniegelenks-SM betroffener Spender wurden primäre menschliche SF isoliert, kultiviert, expandiert und mit TNFα, IL-10 oder TNFα + IL-10 für 24 h stimuliert. Die Genexpressionen von IL-6, IL-10 und Matrixmetalloprotease 1 bzw. 3 (MMP-1; MMP-3) wurden mittels RTD-PCR bestimmt. Die Proteinsynthese derselben Mediatoren wurde per Durchflusszytometrie (FC) und Immunfluoreszenzfärbung (IF) untersucht, die Proteinsynthese von Kollagen I, CD44 und β_1 Integrin mit Western Blot (WB) nachgewiesen. Ferner wurden SF mit adenoviralen IL-10 Überexpressionsvektoren transduziert um einen potenziellen Therapieansatz bei Arthrose zu simulieren. Die Auswirkungen der Transduktion wurden per RTD-PCR überprüft und zusätzlich die IL-10 Proteinsekretion mittels Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) untersucht. Abschließend wurde die permanente Zelllinie K4IM etabliert um für zukünftige Experimente die komplizierte Zellisolierung, langsame Expansion und inter-individuelle Unterschiede zu eliminieren. Ergebnisse: Kultivierte SF wurden durch TNFα bzw. TNFα + IL-10 aktiviert und steigerten die Genexpression von IL-6, IL-10, MMP-1 & -3. Die Untersuchung der Proteinsynthese via IF zeigte Resultate, die mit denen der Genexpression übereinstimmten. Die Ergebnisse der FC zeigten Abweichungen zu den RTD-PCR Beobachtungen. Die durchgeführten WB wiesen nach, dass die Zytokinstimulation auch Auswirkungen auf extrazelluläre Matrixproteine und -rezeptoren hatte, die im Einzelnen sehr unterschiedlich ausfielen. Die adenovirale Transduktion mit IL-10 war erfolgreich. Dessen Genexpression wurde stark gesteigert, aber die Effekte auf die Expression von IL-6, MMP-1 undMMP-3 waren statistisch nicht signifikant. Die K4IM Zelllinie zeigte meist Reaktionen, die mit denjenigen kultivierter humaner SF überein-stimmten. Schlussfolgerung: Kultivierte humane SF werden durch TNFα und TNFα + IL-10 stark aktiviert und steigern die Expression pro-inflammatorischer und kataboler Mediatoren. Diese Ergebnisse werfen mehr Licht auf die Rolle, die SF in der Arthrose-Pathogenese spielen und lassen diese Zellen als Ziel für zukünftige Therapien erscheinen, auch wenn eine IL-10 Überexpression unzureichend für eine effektive Therapie der Osteoarthrose sein dürfte. Die K4IM Zelllinie könnte in zukünftigen Stimulationsexperimenten als passendes Modell für kultivierte humane SF dienen.