Histologische Beurteilung der Auswirkungen des Proteins Sklerostin und der mechanischen Belastung auf die Knochenstruktur und die Knochenheilung in einem Mausmodell

Abstract

Das Frakturrisiko und die Gefahr, eine Knochenheilungsstörung zu entwickeln, ist mit zunehmendem Alter erhöht und wird durch eine Osteoporoseerkrankung weiter gesteigert. Die zunehmende Vergreisung der Gesellschaft führt daher auch zu einer wachsenden finanziellen Belastung des Gesundheitssystems und zu einem steigenden Forschungsinteresse im Bereich der Frakturheilung ebenso wie in der Osteoporose-Therapie. In der vorliegenden Arbeit sollten das Zusammenwirken zweier unterschiedlicher Ansatzpunkte, die Knochenheilung zu beeinflussen, untersucht werden. Sklerostin-neutralisierende Antikörper führen zu einer Steigerung der Knochenbildung und der Knochenmineraldichte und werden derzeit bereits in klinischen Studien geprüft (Agholme et al., 2011b; Padhi et al., 2011). Auch mechanische Belastung hat einen positiven Effekt auf die Knochenmineraldichte (Chilibeck et al., 1995) und einigen Studien zu Folge auch auf die Knochenheilung (Claes et al., 1995; Kim et al., 2003). Ziel des vorliegenden Projektes war es die Wechselwirkungen zwischen mechanischer Stimulation und Sklerostin-neutralisierenden Antikörpern im Rahmen der Knochenheilung zu verstehen. Hierzu wurde bei 120 Mäusen jeweils am linken Femur eine Osteotomie durchgeführt, die mittels eines Fixateur externe unterschiedlicher Beweglichkeit (axiale Steifigkeit von a) 18,18 N/mm bzw. b) 1,89 N/mm) stabilisiert wurde. Die Hälfte der Tiere bekam zweimal pro Woche Sklerostin-neutralisierende Antikörper injiziert. Die übrigen Tiere dienten als Placebo-Gruppe. Nach Standzeiten von sieben, 14 und 21 Tagen wurden die Tiere euthanasiert und die Knochen histologisch und immunhistologisch ausgewertet. Wie erwartet führte die Sklerostin-Antikörpergabe zu einer erhöhten Knochenproduktion was bereits in anderen Studien (Cui et al., 2013; Jawad et al., 2013) beobachtet wurde. Unter semi-steifer Fixation setzte diese gesteigerte Knochenbildung allerdings verspätet ein. In beiden Gruppen war über die drei Wochen ein Anstieg an Knochenmenge zu verzeichnen, wohingegen die Placebo-Gruppe mit steifer Fixation nach 14 Tagen scheinbar bereits Remodeling mit einer wieder abnehmenden Knochenmenge aufwies. In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, inwieweit ein adäquates Remodeling unter dauerhafter Sklerostin-Antikörpergabe möglich ist und welche Konsequenzen daraus für die Therapie von schlecht-heilenden Frakturen entsteht. Weiterhin zeigten beide Gruppen mit semi-steifer Fixation in der zweiten Woche eine stark erhöhte Knorpelproduktion. Dies weist auf eine ungenügende Stabilisierung der Osteotomie durch den semisteifen Fixateur hin. Eine erhöhte Beweglichkeit im Osteotomiespalt führt zu einer verminderten Vaskularisation und damit einhergehend zu einer verstärkten Bildung von knorpeligem Kallus (Mark und Nilsson, 2004; Lienau et al., 2005). Weiterhin wiesen beide Gruppen mit semi-steifem Fixateur eine signifikant schlechtere Frakturüberbrückung an Tag 14 sowie Tag 21 auf. Es ist daher anzunehmen, dass der in dieser Studie verwendete semi-steife Fixateur eine zu große Flexibilität aufwies, um einen positiven Effekt auf die Knochenheilung auszuüben. Auffällig war allerdings, dass unter semi-steifer Fixation die Gabe von Sklerostin-neutralisierenden Antikörpern in der dritten Woche zu einem relativ starken Abfall der Knorpelmenge führte. Der Effekt, den Sklerostin und damit auch die Sklerostinneutralisierenden Antikörper auf die Chondrozyten haben, ist bisher noch unklar und bedarf weiterer Untersuchungen. Die Fixationssteifigkeit scheint die Heilung zu beeinflussen. Unter steifer Fixation war eine deutlich besser Osteotomieüberbrückung nach 14 ebenso wie nach 21 Tagen zu beobachten. Beide Gruppen mit steifem Fixateur zeigten eine ähnliche Osteotomieüberbrückung, allerdings mit mehr Knochen in der Gruppe, die Sklerostin-neutralisierende Antikörper bekam. Schlussfolgernd kann gesagt werden, dass die Behandlung mit Sklerostin-neutralisieren- den Antikörpern zu einer Steigerung der Knochenmenge führt, allerdings mit keiner eindeutigen Verbesserung der Heilung. Über dieWechselwirkung der Antikörper mit mechanischer Stimulation des Knochens lässt sich schwer eine Aussage treffen, da der semi-steife Fixateur vermutlich eine zu große Beweglichkeit zuließ, um einen positiven Einfluss auf die Heilung zu haben. Es sind daher weitere Studien nötig, die die mechanischen Bedingungen für einen positiven Effekt auf die Knochenheilung näher untersuchen.

Risk of fracture and the possibility of developing a dysfunction in fracture healing increase with age and are heightened even further by osteoporosis. An aging society therefore leads to a higher financial burden for the health care system and to an intensified research interest in the fields of fracture healing and osteoporosis therapy. This dissertation examined the interaction of two different approaches to influence fracture healing. Sclerostin- neutralizing antibodies, which are currently being researched in clinical studies, lead to increased osteogenesis and bone mineral density (Agholme et al., 2011a; Padhi et al., 2011). Mechanical strain has a positive effect on bone mineral density (Chilibeck et al., 1995) as well, and some studies suggest that it also positively influences fracture healing (Claes et al., 1995; Kim et al., 2003). The goal of the project described in this dissertation was to understand the interaction between mechanical stimulation and sclerostin-neutralizing antibodies regarding fracture healing. Osteotomy was used on the left femur of 120 mice that was stabilized using an external fixation of various degrees of flexibility (axial stiffnesses of a) 18,18 N/mm and b) 1,89 N/mm, respectively). Half of the animals were injected with anti- sclerostin antibodies twice a week. The remaining animals were used as placebo group. After a period of seven, fourteen, and twenty-one days, the animals were euthanized and their bones were histologically and immune-histologically examined. As observed in previous studies (Cui et al., 2013; Jawad et al., 2013), the injection of anti-sclerostin antibodies led to increased osteogenesis. However, using semirigid fixation, increased osteogenesis was delayed. Over the 3 weeks experimental period, an increase in bone volume could be observed in both groups. In contrast, the placebo group with rigid fixation exhibited remodeling with decreasing bone volume after 14 days. From these results the question arises to what extent an adequate remodeling with continuously administered anti-sclerostin antibodies is possible and what the consequences are for treating poorly healing fractures. Both groups with semirigid fixation also showed a strongly increased production of cartilage in the second week. This suggests that the fracture was not sufficiently stabilized by the semirigid fixator. Increased flexibility of a fracture gap leads to decreased vascularization and as a result to an increased production of cartilaginous callus (Mark und Nilsson, 2004; Lienau et al., 2005). Furthermore on day 14, as well as day 21, both groups with semirigid fixation showed a worse fracture gap bridging than the groups with rigid fixation. It can therefore be assumed that the semirigid fixator used in this study is too flexible to positively influence fracture healing. However, it should be noticed that when using semirigid fixation, administering anti-sclerostin antibodies in the third week resulted in a strong decrease of cartilaginous volume. It still needs to be studied how sclerostin and therefore also sclerostin-neutralizing antibodies affect chondrocytes. Fixation stiffness seems to influence fracture healing. Using rigid fixation, a better fracture gap bridging after fourteen, as well as twenty-one days, could be observed. Similar fracture bridging could be observed in both groups with rigid fixation. However, the group receiving anti-sclerostin antibodies produced more bone. In summary, it can be said that a treatment with sclerostin- neutralizing antibodies leads to an increase in bone volume. However, a better healing cannot explicitly be observed. Regarding the interaction between anti- sclerostin antibodies and mechanical stimulation, it is difficult to draw a conclusion as the semistiff fixator most likely allowed for too much flexibility to positively influence the healing process. Further studies are necessary that examine how mechanical stimuli could have a positive effect on fracture healing.