Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von L-Domänen des humanen endogenen Retrovirus K

Abstract

Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt war die Knospung und Freisetzung der humanen endogen Retroviren der Familie K (HERV-K) nur wenig untersucht. Hingegen existierte eine Vielzahl von Untersuchungen über das Budding von exogenen Retroviren, bei denen „Late assembly“ (L)-Domänen die Abschnürung der Partikel maßgeblich steuern. Im Zuge der Arbeit konnten drei verschiedene L-Domänen von HERV-K(HML-2) identifiziert werden: PTAP, YPETLKL und YP(x6)L. Mutationen der in der p15-Domäne des Gag-Proteins lokalisierten Motive führten zu charakteristisch defekten Budding-Phänotypen, wodurch die Freisetzung der viralen Partikel stark beeinträchtigt wurde. Anhand von Messungen der Reversen Transkriptase-Aktivität in den Überständen von transfizierten HEK-293T- und Tera-1-Zellen war ein signifikanter Rückgang der Partikelfreisetzung aller Mutanten im Vergleich zum Wildtyp nachweisbar. Des Weiteren wiesen alle Mutanten reduzierte Mengen von prozessierten Gag-Proteinen in den ultrazentrifugierten Viruspellets auf. Besonders deutlich war dieser Effekt bei der Inaktivierung des hoch konservierten PTAP-Motivs ausgeprägt. HERV-K Partikel die sich durch ein mutiertes PTAP-Motiv auszeichneten waren häufig in einem späten Stadium der Knospung arretiert oder in Prokapsidketten über dünne Membranbrücken verbunden. Wie bei anderen Retroviren zeigte sich, dass die HERV-K L-Domänen die Virusfreisetzung zelltypabhängig begünstigen. Für ein weiteres, in der Kapsiddomäne des Gag-Proteins lokalisiertes Motiv, konnte keine Beteiligung an der HERV-K Knospung nachgewiesen werden. Ebenso wenig sind die QP1/2-Peptide an dem Freisetzungsprozess der endogenen Viren involviert. Damit die Viren an der Plasmamembran der Zelle knospen können, sind verschiedene Wirtsfaktoren des ESCRT („endosomal sorting complex required for transport“)-Systems notwendig. Eine besondere Rolle stellt hierbei das ESCRT-Protein Tsg101 dar, dessen Mitwirkung am HERV-K Budding belegt werden konnte. Dabei wird Tsg101 über die PTAP-Motive der Gag-Proteine zum Ort der Partikelabschnürung rekrutiert. Des Weiteren führt eine Überexpression von Tsg101 dazu, dass der Buddingdefekt der YPxnL-Mutanten teilweise aufgehoben wird. Neben Tsg101 konnte Alix, eine akzessorische Komponente der ESCRT- Maschinerie, als ein am HERV-K Budding beteiligtes Protein identifiziert werden. Wie Tsg101 fördert Alix das Budding von L-Domänen-Mutanten, woraufhin vermehrt Partikel an der Wirtszellmembran knospen können.

To date, the budding and release of human endogenous retrovirus K has remained only poorly understood. In contrast, there are several studies describing the budding of exogenous retroviruses. These viruses exhibit late assembly (L)-domains that regulate the pinch-off of virus from the host cell membrane. During the course of this project, three different HERV-K(HML-2) L-domains were identified: PTAP, YPETLKL und YP(x6)L. Mutations of L-domain motifs within the p15 domain of the Gag protein resulted in characteristic phenotypes that showed defective budding and severely impaired particle release. By measuring the reverse transcriptase activity in the supernatants of transfected HEK 293T and Tera-1 cells, a significant reduction in the particle release of all mutants compared to the wild type was demonstrated. Furthermore, the level of processed Gag protein in virus pellets was shown to be decreased. However, the most drastic effects on virus release were observed by disrupting the single PTAP motif. Most of the PTAP mutant particles were arrested at a late budding stage or were organized in chain buds, in which different procapsids were connected by thin membrane stalks. As already shown for other retroviruses, the L-domains of human endogenous retrovirus K promote virus release in a cell type-dependent manner. Analysis of a further motif showed that this sequence, located in the capsid domain of the Gag protein, has no influence on HERV-K(HML-2) virus budding. Moreover, QP1/2 peptides play no role in the release of the endogenous viruses. Viruses are able to recruit cellular components of the "endosomal sorting complexes required for transport" (ESCRT) to bud from their host cell membrane. In this study, it was shown that Tsg101, a member of ESCRT system, plays a physiologically relevant role in HERV-K release and assembly. Therefore, the PTAP motif of Gag interacts with Tsg101 and recruits it to the site of particle budding. Furthermore, overexpression of Tsg101 restores the release of HERV-K(HML-2) mutants lacking YPxnL motifs. In addition, overexpression of Alix, an accessory component of ESCRT machinery also involved in HERV-K budding can, like Tsg101, markedly stimulate the budding of diverse HERV-K(HML-2) release mutants.