Spatiotemporal control of clathrin-mediated endocytosis by PI3K C2α and phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate

Abstract

Phosphoinositides (PIs) are rare lipids of the cytoplasmic leaflet of eukaryotic membranes. They serve as spatiotemporal signposts directing proteins to distinct subcellular compartments or membrane domains and thereby contribute to defining membrane identity. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2] is most abundant at the plasma membrane where it regulates signaling, ion channels, actin dynamics, and clathrin-mediated endocytosis (CME). The nucleation and assembly of clathrin-coated pits (CCPs) depends on PI(4,5)P2. After membrane fission, PI(4,5)P2 hydrolysis triggers vesicle uncoating and newly formed vesicles fuse with the early endosomal compartment. Endosomes are highly enriched in phosphatidylinositol-3-phosphate [PI(3)P] and maintenance and functionality of these organelles both require PI(3)P. However, the mechanism of PI conversion on the endocytic route from a PI(4,5)P2 to a PI(3)P enriched membrane is still enigmatic. Here, we show that phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate [PI(3,4)P2] is a novel lipid regulator of CME that is required for the maturation of CCPs. Cells depleted of PI(3,4)P2 by means of the PI(3,4)P2-specific 4-phosphatase INPP4B display endocytic defects characterized by long-lived CCPs. This effect is different from PI(4,5)P2-controlled initiation of CCP formation and demonstrates a dual lipid requirement for the sequential generation of PI(4,5)P2 and PI(3,4)P2 during CME. We further identify the clathrin-associated class II phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K C2α, as the enzyme that synthesizes PI(3,4)P2 at CCPs. RNA interference-mediated depletion of PI3K C2α phenocopies effects seen in cells enzymatically depleted of PI(3,4)P2 and results in a partial loss of PI(3,4)P2 from the plasma membrane. Detailed characterization suggested a late maturation defect of CCPs preceding dynamin-mediated fission. A comprehensive analysis of endocytic proteins revealed the PX-BAR domain protein sorting nexin 9 (SNX9) as an effector of PI(3,4)P2. The recruitment of SNX9 to CCPs arrested at a late stage due to dynamin2-depletion strictly depends on both PI3K C2α and PI(3,4)P2. Furthermore, depletion of SNX9 and its close homolog SNX18 causes endocytic defects akin to loss of PI3K C2α that cannot be rescued by PI-binding deficient mutants of SNX9. Taken together, these observations identify a novel lipid requirement in CME and suggest a continuous mechanism for PI conversion along the endocytic route. Instead of de novo formation of PI(3)P on early endosomes, endocytic vesicle formation is coupled to PI(3,4)P2 synthesis. The phosphatase INPP4A, an effector of the early endosomal GTPase Rab5, would directly generate PI(3)P on membranes en route to early endosomes. These findings establish a novel role of PI(3,4)P2 as a product of a class II PI3K in a central cell physiological process and thus significantly advance our understanding of membrane traffic, the roles of class II PI3Ks, and the physiological importance of PI(3,4)P2.

Phosphoinositide (PIs) sind seltene Lipide der zytoplasmatischen Seite eukaryo-tischer Membranen, die als räumliche und zeitliche Orientierungspunkte für Proteine dienen. Dadurch definieren PIs wesentlich die Identität distinkter zellulärer Membranen. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat [PI(4,5)P2] ist in der Plasmamembran (PM) konzentriert und dort von essentieller Bedeutung für verschiedene Prozesse, darunter die Clathrin- vermittelte Endozytose (CME). Für die Nukleation und Assemblierung Clathrin- ummantelter Membranvertiefungen (CCPs) ist PI(4,5)P2 unverzichtbar. Nach der Abschnürung wird PI(4,5)P2 hydrolysiert und das Vesikel fusioniert mit dem frühen endosomalen Kompartiment. In Endosomen ist Phosphatidy- linositol-3-phosphat [PI(3)P] die dominierende PI Spezies und für die Funktion dieser Organellen unabdingbar. Jedoch ist der Mechanismus der PI Konversion auf der endozytischen Route, die Umwandlung einer PI(4,5)P2- zu einer PI(3)P-reichen Membran, bisher nur unzureichend verstanden. In der vorliegenden Arbeit etablieren wir Phosphatidyl¬inositol-3,4-bisphosphat [PI(3,4)P2] als neuen Lipidregulator der CME, der für die Reifung der CCPs von Bedeutung ist. Mittels der PI(3,4)P2-spezifischen 4-Phosphatase INPP4B von PI(3,4)P2 depletierte Zellen zeigen einen endozytischen Defekt, der durch langlebige CCPs charakterisiert ist. Dieser Effekt unterscheidet sich von der PI(4,5)P2-kontrollierten Initiation der CCP Bildung und zeigt ein Erfordernis der sequentiellen Generierung von PI(4,5)P2 und PI(3,4)P2 auf. Weiterhin identifizieren wir die Clathrin-assoziierte Klasse II Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K), PI3K C2α, als das Enzym, das PI(3,4)P2 an CCPs synthetisiert. Die RNA Interferenz-vermittelte Depletion von PI3K C2α führte zu einer Phänokopie der Effekte, die in PI(3,4)P2-defizienten Zellen auftraten und zu einem partiellen Verlust PI(3,4)P2s von der PM. Detaillierte Untersuchungen deuteten auf einen späten, jedoch vor der Membranfission liegenden, Maturierungsdefekt von CCPs hin. Eine Analyse endozytischer Proteine zeigte das PX-BAR-Domänen Protein sorting nexin 9 (SNX9) als Effektor von PI(3,4)P2 auf. Die Rekrutierung von SNX9 zu arretierten Spätstadium-CCPs in Dynamin2-depletierten Zellen ist strikt von PI3K C2α und PI(3,4)P2 abhängig. Weiterhin führen die Depletion von SNX9 und dessen eng verwandtem Protein SNX18 zu einem dem in PI3K C2α-depletierten Zellen ähnlichen endozytischen Defekt, der nicht von PI-Bindungs-defizienten Mutanten von SNX9 kompensiert werden kann. Diese Daten identifizieren ein neues Lipid- Erfordernis in der CME und legen einen kontinuierlichen Mechanismus der PI Konversion nahe. Anstatt der de novo Bildung von PI(3)P in frühen Endosomen findet PI(3,4)P2-Synthese während der Vesikelbildung statt. Die Phosphatase INPP4A, ein Effektor der früh-endosomalen GTPase Rab5, könnte PI(3)P direkt auf endozytischen Vesikeln generieren, bevor diese mit dem frühen endosomalen Kompartiment fusionieren. Diese Ergebnisse etablieren eine neue Rolle von PI(3,4)P2 als Produkt einer Klasse II PI3K in einem zentralen zellphysiologischen Prozess und tragen daher signifikant zu unserem Verständnis des Membranverkehrs, der Rollen der Klasse II PI3Ks und der physiologischen Bedeutung von PI(3,4)P2 bei.