Dissecting the role of Toll-like receptors in microglia-glioma crosstalk

Abstract

Background Malignant gliomas are the most frequent primary tumors of the brain with poor clinical prognosis. Infiltrating peripheral macrophages and resident microglia contribute significantly to the tumor mass. We have previously shown that microglia as the intrinsic immune competent brain cells, promote glioma expansion through the up-regulation of membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) through microglial Toll-like receptor (TLR) and its adaptor protein molecule myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88). This effect is induced by the soluble factors released by glioma cells. Methods Using in vitro, ex vivo and in vivo techniques I identified the important roles of microglial TLR2 and its endogenous ligand versican in microglia-glioma crosstalk. Results The implantation of mouse GL261 glioma cells into TLR2 knock-out (KO) mice resulted in significantly reduced MT1-MMP expression and enhanced survival rates as compared to wild-type (WT) control mice. TLR2 is highly expressed in human gliomas and its expression inversely correlates with patient survival. I also found that the endogenous TLR2 ligand versican is released by glioma cells and triggers microglial/brain macrophage MT1-MMP expression. The splice variants V0/V1 of versican, but not V2, are highly expressed in mouse and human glioma tissue. Versican silenced gliomas induced less MT1-MMP expression in microglia both in vitro and in vivo. Implanting versican silenced GL261 cells into mouse brain resulted in smaller tumors and longer survival rates compare to controls. Using organotypic brain slices I found that the impact of versican signaling on glioma growth depended on the presence of microglia. Microglia but not astrocyte conditioned medium could induce glioma versican up-regulation. Additionally, an established TLR2 neutralizing antibody reduced glioma induced microglial MT1-MMP expression as well as glioma growth ex vivo. Moreover, I found that TLR2 expression is upreguated in glioma associated microglia, but not in astrocytes. I also demonstrate that another important member of the MMPs family, maxtrix- metalloprotease 9 (MMP-9) is predominantly expressed by glioma associated microglia/macrophages in mouse and human glioma tissue but not by the glioma cells. Supernatant from glioma cells induced the expression of MMP-9 and TLR2 in cultured microglial cells. I identified Toll-like receptor 2/6 as the signaling pathway for the glioma induced upregulation of microglial MMP-9. Both, the upregulation of MMP-9 and TLR2 were attenuated by the antibiotic minocycline in vitro. Conclusion The results thus show that activation of TLR2 converts microglia into a glioma supportive phenotype, this signaling cascade might be a novel target for glioma therapies.

Hintergrund Maligne Gliome sind die am häufigsten auftretenden primären Gehirntumore und mit einer schlechten klinischen Prognose assoziiert. Infiltrierende periphere Makrophagen und residente Mikroglia tragen signifikant zur Tumormasse bei. Wir haben in früheren Studien zeigen können, dass Mikroglia als inhärente immunkompetente Gehirnzellen die Ausbreitung von Gliomen unterstützen. Dies geschieht durch die verstärkte Expression der Membrane-type 1 Matrix Metalloprotease (MT1-MMP), welche durch den mikroglialen Toll-like Rezeptor (TLR) und dem Adapterprotein „Myeloid differentiation factor 88“ (MyD88) reguliert wird. Dieser Effekt wird von löslichen Faktoren induziert, die wiederrum von Gliomzellen abgegeben werden. Methoden Mit Hilfe von in vitro, ex vivo und in vivo Techniken habe ich die wesentlichen Rolle von Mikroglia assoziierten TLR2 und ihrem endogenen Liganden Versican innerhalb der Mikroglia-Gliom-Interaktion identifiziert. Ergebnisse Das Implantieren von murinen GL261-Gliomzellen in TLR2 „knockout“ (KO)-Mäuse hatte, im Vergleich zum Wildtyp (WT), eine signifikant verringerte MT1-MMP-Expression und eine erhöhte Überlebensrate zur Folge. TLR2 ist in humanen Gliomen stark exprimiert, wobei sich die Expressionsrate umgekehrt proportional zur Überlebenschance der Patienten verhält. Ich habe außerdem gezeigt, dass der endogene TLR2-Ligand Versican von Gliomzellen abgegeben wird und die MT1-MMP-Expression in Mikroglia/Gehirnmakrophagen einleitet. Die Spleißvarianten von Versican V0/V1, aber nicht V2, sind im hohen Maße in murinem und humanem Gliomgewebe exprimiert. In in vitro und ex vivo Experimenten führte die Abschaltung von Versican in Gliomen zu verringerter MT1-MMP-Expression der Mikroglia. Im Vergleich zu Kontrollen führte das Implantieren von für Versican stummgeschalteten GL261 Zellen zu kleineren Tumoren und verbesserten Überlebensraten. Mit Hilfe von organotypischen Gehirnschnitten konnten wir zeigen, dass der Einfluss von Versican auf das Gliomwachstum von Mikrogliapräsenz abhängig ist. Mikroglia-, jedoch nicht Astrozyten-konditioniertes Medium, bedingt Gliom assoziierte Versican Hochregulierung. Zusätzlich verringert ein TLR2 neutralisierender Antikörper Gliom-induzierte mikrogliale MT1-MMP-Expression und Gliomwachstum ex vivo. Darüber hinaus konnten ich zeige, dass die TLR2-Expression in Gliom- assoziierten Mikroglia, jedoch nicht in Astrozyten erhöht ist. Ich konnte außerdem demonstrieren, dass ein weiteres wichtiges Mitglied der MMP-Familie, die Matrix-Metalloprotease 9 (MMP-9), vorwiegend in murinen und humanen Gliom- assoziierten Mikroglia/Makrophagen exprimiert wird, allerdings nicht in Gliomzellen. Der Überstand von Gliomzellen induzierte die Expression von MMP-9 und TLR2 in kultivierten Mikrogliazellen. Der Toll-like Rezeptor 2/6 konnte von uns als Signalweg für die gliominduzierte Hochregulierung von mikroglialem MMP-9 identifiziert werden. Das Antibiotikum Minocyclin hat die Hochregulierung von MMP-9 und TLR2 in vitro verringert. Fazit Meine Ergebnisse zeigen daher, dass die Aktivierung von TLR2 Mikroglia in den Gliom unterstützenden Phänotyp umwandelt. Diese Signalkaskade könnte ein neuer Ansatzpunkt für die Therapie von Gliomen darstellen.