Role of interleukin-6 on breast cancer cell growth in bone

Abstract

Breast cancer metastasizes preferentially to bone where it causes mostly osteolytic lesions. Interleukin-6 (IL-6) plays a major role in the response to injury or infection and is involved in the immune response, inflammation and haematopoiesis. Its deregulation impacts numerous disease states, including breast cancer. There is good clinical evidence that high serum IL-6 levels in breast cancer patients correlate with poor prognosis and rapid disease progression. Conversely, several in vitro and in vivo studies have demonstrated that lower IL-6 levels are associated with reduced cancer cell growth. Therefore, IL-6 seems to be an important player in the development of breast cancer metastasis in bone. The overarching aim of my research was to better understand the role of IL-6 in breast cancer bone metastasis and breast cancer cell growth. To this end, I used a xenograft model of osteolytic breast cancer metastasis in which IL-6 production by the cancer cells had been reduced through genetic manipulation, or IL-6 receptor signalling had been blocked through administration of a humanized anti-IL-6 receptor (IL-6R) antibody. The following specific aims were defined: 1) To assess the effect of IL-6 knock down in human MDA-MB-231 breast cancer cells on cancer cell growth in vitro, and in vivo within the bone microenvironment. 2) To investigate the effect of IL-6 knockdown on breast cancer cell growth in a non-skeleta environment (mammary fat pad). 3) To investigate the autocrine effects of IL-6 signalling on MDA-MB-231 breast cancer cell growth in vitro and in vivo, using the anti-IL-6R antibody, Tocilizumab. Overall, results were as follows: 1) Interleukin-6 (IL-6) knock down in MDA-MB-231 breast cancer cells through lentiviral transduction lead to a reduction of IL-6 mRNA and protein production by more than 50%. This did not have an effect on MDA-MB-231 cell growth but reduced invasive properties of the cells in vitro. 2) Compared to non-target controls, knockdown of endogenous IL-6 production in breast cancer cells by stable shRNA expression led to a significant reduction of cell growth within the bone microenvironment. 3) IL-6 knockdown cells injected into the mammary fat pad of nude mice grew similarly to their non-target counterparts, indicating that the effect of IL-6 on cancer cell growth depends on, and is mediated by, the bone microenvironment. 4) Partial inhibition of autocrine IL-6 signalling in breast cancer cells through treatment with the anti-human IL-6R antibody, Tocilizumab, at low dose resulted in clear, albeit statistically not significant reduction of breast cancer cell growth within the bone microenvironment. When metastatic breast cancer cells invade the bone microenvironment, the balance of slow and continuous bone turnover is usually disturbed in favour of net bone loss. The vicious cycle is a model of breast cancer metastasis to bone that explains how tumour cells induce matrix degradation through osteoblast and osteoclast activation, which in turn leads to the release of growth factors from the bone matrix that support tumour cell growth. In the aforementioned experiments, IL-6 deficient cells grew slower in the bone microenvironment than their non-target counterparts, and it is highly likely that this is due to the lack of IL-6 action within the vicious cycle. This assumption is supported by the fact that no growth retardation was observed in tumours derived from IL-6 deficient cells implanted into the mammary fat pad. My findings may have clinical implications since the anti- human IL-6R antibody, Tocilizumab, is clinically available and therefore could be used in the treatment of patients with advanced and intractable metastatic IL-6 producing (oestrogen receptor negative) breast cancer.

Brustkrebs metastasiert vorwiegend in den Knochen, wo er zu mehrheitlich osteolytischen Läsionen führt. Interleukin-6 (IL-6) spielt eine wichtige Rolle in der Reaktion des Körpers auf Verletzungen und bei Infektionen. Es ist weiterhin an der Immunantwort, Entzündungsvorgängen und der Hämatopoese beteiligt. Eine Dysregulation des IL-6 Haushaltes spielt bei vielen Krankheiten und auch bei Brustkrebs eine wichtige Rolle. Es gibt viele klinische Hinweise darauf, dass hohe IL-6 Titer im Blut bei Brustkrebspatientinnen mit einer schlechten Prognose und schneller Krankheitsprogression einhergehen. Umgekehrt haben mehrere in vivo und in vitro Studien gezeigt, dass niedrige IL-6 Level mit einem verringerten Krebszellwachstum einhergehen. Daher scheint IL-6 eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Brustkrebsmetastasen im Knochen zu spielen. Das Hauptanliegen dieser Arbeit war es, die Rolle von IL-6 bei der Brustkrebsmetastasierung und dem Brustkrebswachstum im Knochen besser zu verstehen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde ein Xenotransplantatmodell osteolytischer Brustkrebsmetastasen verwendet, bei dem die IL-6 Produktion durch die Brustkrebszelle durch genetische Manipulation reduziert wurde, beziehungsweise der IL-6 Rezeptorsignalweg durch einen humanisierten IL-6 Rezeptorantikörper blockiert wurde. Folgende spezifische Ziele wurden definiert: 1) Beurteilung der Auswirkungen des IL-6 Knockdowns in humanen MDA-MB-231 Brustkrebszellen auf das Krebszellwachstum im Knochenmilieu in vivo und in vitro. 2) Beurteilung der Auswirkungen des IL-6 Knockdowns auf das Brustkrebszellwachstum außerhalb des Knochenmilieus (im mammären Fettpolster). 3) Beurteilung des autokrinen Effektes der IL-6 Signalübertragung auf das Wachstum von MDA-MB-231 Brustkrebszellen, unter Verwendung des IL-6 Rezeptor Antikörpers Tocilizumab. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1) Der Knockdown von Interleukin-6 (IL-6) in MDA-MB-231 Brustkrebszellen durch lentivirale Transduktion führte zu einer Senkung der IL-6 mRNA und der Proteinproduktion um mehr als 50 %. Dies hatte keinen Einfluss auf das Wachstum der MDA-MB-231 Zellen in vitro, senkte jedoch die invasiven Eigenschaften der untersuchten Zellen. 2) Im Vergleich zu den Non-Target Kontrollzellen führte der Knockdown der endogenen IL-6 Produktion durch stabile shRNA Expression zu einer signifikanten Verlangsamung des Zellwachstums im Knochenmilieu. 3) IL-6 Knockdown Zellen wuchsen genauso schnell außerhalb des Knochenmilieus wie die Non-Target Kontrollzellen, was darauf hindeutet, dass der Effekt von IL-6 auf das Krebszellwachstum durch das Knochenmilieu vermittelt wird. 4) Teilweise Inhibition des autokrinen IL-6 Signaltransduktionsweges durch Administration des humanisierten IL-6 Rezeptorantikörpers Tocilizumab in geringer Dosierung, führte zu einer sichtbaren, jedoch nicht statistisch signifikanten Wachstumsverminderung des Brustkrebszellwachstums im Knochenmilieu. Wenn metastasierte Brustkrebszellen in das Knochenmilieu eindringen, stören sie den sorgfältig balancierten Knochenstoffwechsel und verschieben ihn meist zugunsten des Knochenabbaus. Der „Vicious Cycle“ ist ein Modell der Brustkrebsmetastasierung in das Skelett, welches erklärt, wie Brustkrebszellen den Knochenmatrixabbau durch die Aktivierung von Osteoklasten und Osteoblasten induzieren. Beim Abbau der Matrix kommt es zur Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus dem Knochen, welche wiederum das Brustkrebszellwachstum fördern. In den oben genannten Experimenten wurde festgestellt, dass IL-6 defiziente Zellen im Knochenmilieu langsamer wuchsen als ihre Non-Target Kontrollzellen und es ist sehr wahrscheinlich, dass dies der fehlenden Wirkung des IL-6 auf den „Vicious Cycle“ geschuldet ist. Diese Annahme wird durch die Tatsache gestützt, dass keine Wachstumsverlangsamung des Tumors aus IL-6 defizienten Zellen im mammären Fettpolster, also außerhalb des Knochenmilieus, beobachtet werden konnte. Die Ergebnisse könnten von klinischer Bedeutung sein, da der IL-6 Rezeptorantikörper Tocilizumab klinisch zur Verfügung steht und somit bei Patientinnen mit fortgeschrittenem, therapierefraktärem, IL-6 produzierendem (Östrogenrezeptor negativen) Brustkrebs zum Einsatz kommen könnte.