Identification, localization and characterization of trace element-binding proteins in the respiratory tract of the rat

Abstract

Trace elements may have either beneficial or harmful effects. Their behaviour depends to a large extent on their chemical forms and on their concentrations in the body compartments. The determination of their tissue levels and their binding forms in the tissues are therefore important steps in trace element research. The surface of the lung and trachea is continuously exposed to gases and particular matter present in the atmosphere. In order to be protected against exposure to oxidants, a specific antioxidant defense system is required. Several enzymes with antioxidative functions are known to contain metals or metalloids as essential constituents of their active centre. In addition, there may be further protective trace-element-containing proteins not yet identified. It is therefore of great interest to determine the trace elements present in the respiratory tract and to obtain information on their subcellular distribution, their chemical forms and their biological effects. In these studies element analytical methods were combined with biochemical separation procedures. Subcellular separation of the rat lung and trachea into nuclear, mitochondrial, microsomal and cytosolic fractions was achieved by differential ultracentrifugation. Instrumental neutron activation analysis (INAA) was used to determine the concentrations of several trace elements such as selenium, arsenic, iron, manganese, zinc, cobalt, rubidium and chromium in the whole organs and their subcellular fractions. Atom absorption spectrometry (AAS) was employed for the determination of copper and nickel in the mitochondrial and cytosolic fractions of the lung and trachea. After separation of the proteins in the rat lung and trachea cytosol by size exclusion chromatography (SEC), inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) was used to obtain first information on the trace element-containing proteins present in these compartments. In order to find out about selenium- containing and arsenic-containing proteins in the tissues of respiratory tract, tracer experiments were carried out. In this case the rats were labeled in vivo either with 75Se or with 73As. The tissues were then homogenized and fractionated into several subcellular compartments. Selenium- or arsenic- containing proteins in these compartments were investigated by gel electrophoretic separation of the proteins and autoradiographic detection of the tracer. In this way about 24 selenium-containing proteins or protein subunits could be distinguished in the tissues and their subcellular fractions. Their molecular masses were in the range between 10-30 kDa and 50-80 kDa, with pI values between 3 and 10. After evaluation of the autoradiograms from samples labeled with 73As several arsenic-binding proteins were detected. Their relative molecular masses were: >250 kDa, 75 kDa, 50 kDa, 37 kDa, 29 30 kDa, 25 kDa, 16 kDa, and 15 kDa. There were differences between their distribution among the cellular compartments. This suggests that the arsenic compounds are involved in different intracellular processes.

Als Spurenelemente werden diejenigen chemischen Elemente bezeichnet, die einen Anteil von weniger als 0,01% an der Körpermasse haben. Essentiell werden Elemente genannt, wenn ihr Mangel physiologische Funktionen beeinträchtigt und durch Suplementierung diese Mangelerscheinung verhindert oder rückgängig gemacht werden kann. Zu den essentiellen Elementen gehören: Fe, Zn, Cu, I, Se, Mn, Co und Cr. Bei anderen im Organismus vorkommenden Elementen konnte bis heute noch nicht geklärt werden, ob sie ebenfalls essentielle Funktionen besitzen. Einige von ihnen haben jedoch toxische Eigenschaften. Die Funktionen der Spurenelemente variieren von Element zu Element ganz erheblich. Sie hängen vor allem von ihrer Bindung an unterschiedliche Proteine ab. Ca. 1/3 der heute bekannten Proteine enthalten Spurenelemente, die für ihre biologischen Wirkungen unerlässlich sind. Die meisten dieser spurenelementhaltigen Proteine sind noch nicht erforscht. Ihre Identifizierung und die Aufklärung ihrer Eigenschaften und Funktionen sind für viele Gebiete der Lebenswissenschaften von großem Interesse. Hierbei können die folgenden Untersuchungsschritte wichtige Informationen liefern: Bestimmung von Spurenelementen in den Geweben, Bestimmung der subzellulären Spurenelementverteilung, Identifizierung von Spurenelement-Protein-Komplexen, Aufklärung ihrer biologischen Wirkungen. In dieser Arbeit wurden Gewebe des Atmungstraktes (Lunge und Trachea) untersucht. Die Gewebe des Atmungstrakts sind durch ständigen Kontakt mit verschiedenen in der Atmosphäre vorkommenden Gasen und Partikeln sowie Toxinen (z.B. Asbest oder Tabakrauch) einem erheblichen oxidativen Stress ausgesetzt. Der Atmungstrakt besitzt das größte Endothel von allen Organen und damit eine sehr große Angriffsfläche für Oxidantien. Deswegen benötigen die Organe des Atmungtraktes ein spezielles Verteidigungssystem gegen Oxidantien und freie Radikale. In diesem antioxidativen Schutzsystem können metall- und metalloidhaltige Enzyme eine wichtige Rolle spielen. Die Instrumentelle Neutronaktivierungsanalyse (INAA) wurde eingesetzt, um die Konzentrationen der Spurenelemente (Se, As, Fe, Mn, Zn, Co, Rb, Cr) in der Lunge und Trachea von selenadäquat ernährten Ratten und Ratten mit Selenmangel zu bestimmen. Wie zu erwarten war, war die Konzentration von Selen in den Geweben und subzellulären Fraktionen der selendefizient ernährten Tiere geringer. Für alle anderen untersuchten Elemente wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen beobachtet. In ersten Untersuchungen wurden metallhaltige Proteinfraktionen in den Zytosolen mit Hilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) aufgetrennt und die Elemente mit der induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) on-line detektiert. Die chromatographischen Profile von Selen, Arsen, Nickel, Eisen, Kupfer, Mangan, Cadmium, Silber, Molybdän und Kobalt weisen darauf hin, dass außer Rubidium alle untersuchten Elemente an zytosolische Proteine gebunden sind. Erstmalig wurden für Arsen und Nickel Proteinbindugen in den Zytosolen von Lunge und Trachea nachgewiesen. Für detailliertere Untersuchungen wurden die Elemente Se und As ausgewählt, um weitere Informationen zu ihrem Metabolismus und ihren Funktionen zu erhalten. Durch Markierung von Ratten in vivo mit 75Se, Trennung der Gewebeproteine mit gelelektrophoretischen Methoden und autoradiographischen Nachweis der Tracerverteilung wurde gezeigt, dass in der Lunge und Trachea 24 selenhaltige Proteine mit molekularen Massen in den Bereichen von 10-30 kDa und 50-80 kDa und pI Werten von 3-10 existieren. Zur Untersuchung der biologischen Bedeutung von Arsen wurden selendefizient und selenadäquat ernährte Ratten in vivo mit 73As markiert. Die Elementverteilung in den Geweben und in den subzellulären Fraktionen zeigte eine starke Abhängigkeit der Elementverteilung von dem Selen-Status der Tiere. Nach gelelektrophoretischer Trennung und autoradiographischem Nachweis des Tracers wurden in den Geweben erstmalig arsenhaltige Proteine gefunden. Die molekularen Massen dieser Proteine waren: > 250 kDa, 75 kDa, 50 kDa, 37 kDa, 29 30 kDa, 25 kDa, 16 kDa und 15 kDa. Die Auswertung der Autoradiogramme zeigte Unterschiede in der Verteilung der arsenbindenden Proteine in den verschiedenen Geweben und subzellulären Fraktionen. Diese Unterschiede weisen darauf hin, dass die arsenhaltigen Proteine in unterschiedliche intrazelluläre Prozesse involviert sind.