Structure and function of the autotransporter protein YadA: A solid-state MAS NMR study

Abstract

Bacterial infection starts with colonization of the host organism. For this purpose, pathogenic bacteria assemble several molecular complexes on their surfaces such as pili, fimbriae, membrane-anchored fibres etc., collectively called adhesins. Yersinia adhesin A (Yad A) is one of the virulence factors of Yersinia Enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis and is the prototype of non-fimbrial, non-pilus Trimeric Autotransporter Adhesins (TAAs). The C-terminal transmembrane anchor domain of YadA forms a highly stable trimeric beta barrel in the outer membrane. The general feature of all TAAs is that they export their own coiled-coil stalk, with their head at the N-terminus (stalk and head domains are collectively called passenger domain) into the extracellular milieu without aid of ATP. Once outside the cell, the sticky head domain can bind to extracellular matrix proteins of the host such as, fibronectin, collagen, and laminin. Invasion of the host can lead to various enteric foodborne diseases, e.g., enterocolitis, acute enteritis, diarrhoea, mesenteric lymphadenitis, septicaemia, and reactive arthritis to autoimmune disorders. Although several attempts have been made to understand the autotransport mechanism, detailed insight in the mechanism based on experimental evidence is missing. Knowledge of the structure and dynamics of domains involved in autotransport can contribute to understanding the autotransport mechanism and can shed light on the process of bacterial adhesion. Membrane proteins are heavily underrepresented in the Protein Data Bank (PDB) despite being involved in numerous cellular processes of phenomenal importance and being prime focus of pharmaceutical industry. The large molecular size, slow tumbling motion, low solubility, intrinsic heterogeneity, and the presence of flexible loops are inherent characteristics of membrane proteins which make them difficult to study by most high resolution techniques. Solid-state NMR (ssNMR), on the other hand, does not rely on the availability of high quality crystals, rapid molecular tumbling, or the size of the complex; therefore, ssNMR serves as a promising method for structural studies of quasi-immobilized solid or solid-like macromolecular complexes including membrane proteins and amyloid fibrils. In addition, ssNMR is also able to give information about the dynamics of pharmaceutically important protein-protein and protein-ligand binding sites. The first step towards the structure determination by magic-angle spinning (MAS) ssNMR as reported in this thesis was the sequence-specific chemical shift assignment of virtually all spin systems in the symmetric YadA-M trimer (11.3 kDa, 105 amino-acid residues per monomer). Several two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) homo and heteronuclear correlation spectra were recorded on a single, uniformly 13C, 15N labelled micro-crystallized YadA-M (membrane anchor domain of YadA) preparation. 2D homonuclear 13C correlation spectra served to identify different spin systems upon their characteristic fingerprint cross- peak pattern. Sequential links among the spin systems were established by selective transfer between the backbone 15N amide to either the Ca or C` in 3D NCACX and 3D NCOCX experiments. The chemical shift values (13C and 15N) were used to predict the secondary structure of YadA-M which consists of four anti- parallel beta strands and one alpha helix for each monomer. In the next step, various experiments under specific and nonspecific recoupling conditions at multiple mixing times were recorded to achieve a sufficient number of medium and long-range structural restraints. The definition and registry of intra and inter-monomer beta strands was determined by careful observation of 2D ChhC type spectra which are rich in long range cross-strand contacts. In addition, 2D PAR, DARR, TEDOR, NhhC and PDSD spectra at different mixing times provided complementary distance information. Single- and double-methyl filtered 2D DARR spectra with extended mixing times were a useful addition to the data set and provided distance restraints that originated specifically from side-chain methyl groups. Long-range contacts between strands and helices were identified that assisted in defining the trimeric structure of the membrane anchor domain. Analysis of the NMR data set resulted in a substantial amount of structuredefining restraints that served as input for multiple computational tools, such as ISD and ARIA, to derive the tertiary and quaternary (trimeric) structure of YadA-M. Thus, a de novo structure of the beta barrel membrane protein was obtained on the basis of MAS solid-state NMR data. It was found that a quartet of helical residues (named the “ASSA” region) displays random- coil-like chemical shifts, low order-parameters, reduced helix propensity, and a drop in signal intensity, pointing towards a relatively increased flexibility. Evolutionary studies revealed that this region is highly conserved and shows high preference for small side-chain residues. From coiled-coil analysis, a switch from a classical seven-residue repeat to a straighter, eleven-residue repeat was observed, which ends at the ASSA region. Based on combined structural and evolutionary studies, the work reported in this thesis is in strong favour of the ‘hairpin model’ as mechanism of the autotransport; the ASSA region was identified as flexible linker that functions as the hairpin at the onset of the autotransport and plays an important role in the C- to N-terminal passage of the polypeptide through the beta barrel. Residues in the ASSA region show interactions with the small side-chain residues of the interior wall, i.e., A37-A68, A41-G61, and L45-G72, which necessarily stabilize the ASSA region after the transport is accomplished. In addition, an uncommon, non-covalent S···O interaction was reported which was observed between the side-chain oxygen atoms of S38- S39 and the sulphur atom of M96. Intermolecular peaks (crystal contacts) were also observed which gave a tilted up-and-down organization for the neighbouring trimers. Amino-acid residues involved in crystalline contacts exhibit heterogeneously broadened NMR signals. This thesis demonstrates, for the first time, that solid-state MAS NMR is able to solve the structure of membrane proteins from a single, uniformly 13C, 15N labelled sample. The structure of YadA-M provides important insights into the structural and functional aspects of the autotransporter domain of YadA; moreover, the results are in good agreement with the hairpin model, which is most likely conserved for all trimeric autotransporters.

Bakterielle Infektionen beginnen mit dem Eindringen in die Wirtszelle. Zu diesem Zweck exprimieren pathogene Bakterien verschiedene molekulare Komplexe an ihrer Oberfläche, wie z.B. Pili, Fimbrien, Membran-verankerte Fäden usw. Diese werden zusammenfassend als Adhäsine bezeichnet. Yersinia Adhäsin A (YadA) ist ein Virulenzfaktor von Yersinia enterocolitia und Yersinia pseudotuberculosis sowie ein typisches Beispiel eines trimären Autotransporter-Adhäsins (TAA), welche weder Fimbrien noch Pili sind. Die C-terminale Ankerdomäne von YadA formt ein höchst stabiles trimäres beta-Fass in der äußeren Membran. Alle TAAs können ohne Hilfe von ATP ihren eigenen Doppelhelix-Fortsatz in die extrazelluläre Matrix exportieren. Am N-Terminus dieses Fortsatzes befindet sich eine Kopfdomäne und ihre Gesamtheit wird als „passenger“ Domäne bezeichent. Außerhalb der Zelle kann sich die klebrige Kopfdomäne an verschiedene Zelltypen und an die extrazellulären Matrixproteine des Wirts (z.B. Fibronectin, Kollagen und Laminin) binden. Die Infektion des Wirts kann zu verschiedenen Lebensmittelvergiftungen und nachfolgenden Krankheitsbildern führen, wie z.B. zu Enterocolitis, akute Enteritis, Diarrhoe, mesenterialer Lymphadenitis, Blutvergiftung, bis hin zu Autoimmunstörungen durch reaktive Arthritis. Obwohl verschiedene Versuche unternommen wurden den Autotransport-Mechanismus zu verstehen, fehlt es an experimentellen Daten für ein detailliertes Verständnis. Erkenntnisse bezüglich der Struktur und Dynamik der am Autotransport beteiligten Domänen können zum Verständnis des Autotransport-Mechanismuses beitragen sowie den Prozess der bakteriellen Adhäsion erhellen. Obwohl Membranproteine in viele zelluläre Prozesse maßgeblich involviert sind und daher im Fokus der pharmazeutischen Industrie stehen, sind sie in der Protein Datenbank (PDB) stark unterrepräsentiert. Membranproteine sind aufgrund ihrer molekularen Größe, der damit verbundenen langsamen Taumelbewegung, sowie ihrer schlechten Löslichkeit, ihrer strukturellen Heterogenität und ihren flexiblen Schleifen schlecht mit hochauflösenden Techniken zu studieren. Festkörper-NMR (solid- state NMR; ssNMR) hingegen ist nicht abhängig von der Qualität der Kristalle, einer schnellen molekularen Bewegung oder der Größe des Komplexes. Daher ist ssNMR eine vielversprechende Methode für strukturelle Studien an immobilisierten, makromolekularen Komplexen von Membranproteinen oder Amyloidfibrillen. Zudem ist ssNMR in der Lage, Informationen über die Dynamik pharmakologisch wichtiger Strukturen zu geben, wie z.B. die Bereiche von Protein-Protein Interaktionen oder Liganden-Bindungen. Der erste Schritt zur Strukturbestimmung durch ssNMR unter Drehung im magischen Winkel (magic-angle spinning; MAS) ist, wie in dieser Arbeit beschrieben, die sequenzspezifische Zuordnung der chemischen Verschiebungen nahezu aller Spinsysteme im symetrischem YadA-M Trimär (11,3 kDa, 105 Aminosäuren pro Monomer). Verschiedene 2D und 3D homo- und hetronukleare Korrelationsspektren wurden von uniform 13C, 15N markiertem, mikrokristallinem YadA-M aufgenommen. 2D homonukleare 13C Korrelationsspektren wurden benutzt, um verschiedene Spinsysteme durch ihre charakteristischen Muster aus Kreuz-Signalen zu identifizieren. Sequenziell verknüpft wurden die Spinsysteme durch einen selektiven Transfer ausgehend von den 15N Amiden der Hauptkette zu entweder C-alpha oder C` mit 3D NCACX und 3D NCOCX Experimenten. Die chemischen Verschiebungen (13C und 15N) wurden verwandt um die sekundäre Struktur des YadA-M zu bestimmen, wobei jedes Monomer aus vier anti-parallelen ß-Strängen und einer alpha-Helix besteht. Anschließend wurden verschiedene Experimente unter spezifischen und nicht-spezifischen „recoupling“ Bedingungen und mit unterschiedlichen Mischzeiten aufgenommen. Damit konnte eine hinreichende Anzahl von Atomabständen mittlerer und langer Distanz bestimmt werden. Die intra- und intermonomäre Anordung der beta-Stränge wurde durch 2D ChhC Spektren ermittelt. Diese zeigen viele Kontakte über lange Entfernungen und zwischen benachbarten Strängen. Weiterhin lieferten 2D PAR, DARR, TEDOR, NhhC und PDSD Spektren mit unterschiedlichen Mischzeiten ergänzende Abstands- Informationen. Einfach und doppelt Methyl-gefilterte 2D DARR Spektren mit verlängerten Mischzeiten ergänzten die Abstands-Informationen, ausgehend von den Methylgruppen der Seitenketten. Zusätzlich halfen Kontakte über lange Abstände zwischen den einzelnen Strängen und Helices bei der Bestimmung der trimären Struktur der Ankerdomäne. Insgesamt resultierte die Auswertung der NMR Daten in einer Vielzahl von struktur-bestimmenden Abstands- Einschränkungen. Diese bildeten die Grundlage für verschiedene computergestütze Methoden (z.B. ISD und ARIA), um die tertiäre und quartäre (trimäre) Struktur des YadA-M abzuleiten. So wurde de novo die Struktur des Membranproteins als ß-Fass bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass ein Quartett von Seitenketten in einer Helix (ASSA Region) chemische Verschiebungen aufweist, die typisch für eine ungeordnete Sekundärstruktur, jedoch untypisch für eine Helix sind. Des Weiteren deutet eine reduzierte Signalintensität auf eine relativ hohe Flexibilität dieser Seitenketten hin. Evolutionsstudien haben gezeigt, dass diese Region stark konserviert ist und meistens aus Aminosäuren mit kleinen Seitenketten beteht. Eine Analyse der Doppelhelix ergab, dass statt des klassischen Modells (sieben Aminosäuren pro Windung) eine geradere Form mit elf Aminosäuren pro Windung vorliegt. Diese Helix endet an der ASSA Region. Basierend auf einer Kombination der strukturellen Daten und evolutionärer Studien, folgt der Mechanismus des Autotransports dem sogenannten „hairpin“-Modell. Die ASSA Region wurde dabei als das flexible Bindeglied identifiziert, welches beim Beginn des Autotransports den „hairpin“ formt. Sie spielt damit eine entscheidende Rolle bei der Passage des Polypeptids vom C- zum N-Terminus durch das ß-Fass. Die Seitenketten der ASSA Region interagieren mit kleinen Seitenketten der Innenwand, z.B. A37-A68, A41-G61 und L45-G72, und stabilisieren zwangsläufig die ASSA Region nach erfolgtem Transport. Zudem wurde eine ungewöhnliche, nicht-kovalente S-O Interaktion zwischen den Sauerstoff Seitenketten-Atomen von S38, S39 und dem Schwefelatom von M96 beobachtet. Intermolekulare Signale (Kristall-Kontakte) wurden gemessen, welche auf eine alternierende Anordung (oben-unten) von benachbarten Trimären hinweisen. Resonanzen von Aminosäuren, die an Kristallkontakten beteiligt sind, sind heterogen verbreitert. Die vorliegende Dissertation zeigt erstmalig, dass ss-MAS-NMR geeignet ist, die Struktur von Membranproteinen unter Verwendung einer einzigen uniform 13C, 15N markierten Probe aufzuklären. Die Struktur von YadA-M ermöglicht einen wichtigen Einblick in die strukturellen und funktionellen Aspekte der Autotransport-Domäne von YadA. Des Weiteren stützen die Resultate das „hairpin“-Modell, welches höchst wahrscheinlich für alle trimären Autotransporter konserviert ist.