The anti-tumourigenic action of the progesterone receptor antagonist Lonaprisan (ZK230211) in breast cancer

Abstract

Mammary gland development starts during embryogenesis and continues at puberty in response to circulating estrogen and growth hormones. Full development however only takes place during pregnancy in preparation for lactation, due to increased estrogen and progesterone levels. A role of progesterone in breast cancer has furthermore been debated for many years. Although it has been shown that some estrogen/progestagen combinations used in hormone replacement therapy may be linked to increased breast cancer risk, it is also true that the progestins used in these therapies have different mixed agonist/antagonist profiles and are not necessarily entirely selective for the PR (progesterone receptor). In addition, progesterone has a biphasic effect on cell proliferation and is difficult to study in isolation from other hormones that also contribute to breast cancer biology. Nevertheless, the presence of PR in about one third of breast cancer cases and the observed link between PR isoform dysbalance and tumor aggressiveness suggest that potent and selective PR antagonists may help in preventing tumor progression. Several antiprogestins have already been described but only few have reached the clinic for various indications including contraception, endometriosis, and uterine leiomyoma. In this thesis the effects of the new antiprogestin Lonaprisan on the T47D breast cancer cell line were studied. Strong inhibition of cell proliferation and arrest in the G0/G1 phase were observed, as well as induction of a senescence-like phenotype. This was accompanied by p21 induction through direct binding of Lonaprisan-bound PR to the promoter. In addition, the stimulation in p21 expression by Lonaprisan necessitated the presence of Sp1, and the reduction of p21 levels blunted the antiproliferative effects of Lonaprisan. Mutation analysis showed that intact PR DNA-binding properties were needed for p21 induction. Phosphorylation of PR Ser345 was stimulated by Lonaprisan, but this post-translational modification was not required for p21 promoter activation, nor was the interaction with c-Src needed. It has also been shown that PR expression is regulated by p21, leading to the hypothesis of the existence of a positive feedback mechanism between PR and p21 after Lonaprisan treatment. Altogether these results, which deepen our understanding on the relationship between PR and the cell cycle regulatory protein p21, may offer new insights for the development of novel therapy options in the treatment of hormone-dependent breast cancer and for the prevention of recurrence.

Die Entwicklung der Brustdrüse beginnt in der Embryogenese und setzt sich während der Pubertät als Antwort auf die Stimulierung durch Estrogene und Wachstumshormone fort. Eine vollständige Ausbildung findet allerdings nur in der Schwangerschaft in Vorbereitung auf die Laktationsperiode durch Estrogen- und Progesteronstimulation statt. Eine Rolle des Progesterons im Brustkrebs wird seit Jahren diskutiert und es wurde gezeigt, dass einige Estrogen/Progestagen Kombinationen, die in der hormonellen Therapie eingesetzt werden mit einem erhöhten Brustkrebsrisiko in Zusammenhang stehen. Allerdings wurden hier unterschiedliche Progestine mit unterschiedlich gemischten agonistischen/antagonistischen Profilen verwendet, die nicht unbedingt für den Progesteron-Rezeptor (PR) selektiv waren. Ausserdem hat Progesteron einen zweiphasigen Einfluss auf die Zellproliferation und es ist schwierig die Rolle von Progesteron getrennt von der anderer Hormone, die auch für Brustkrebs verantwortlich sein könnten, zu untersuchen. Dennoch deutet die Anwesenheit des PR in etwa einem Drittel der Brustkrebsfälle und der beobachtete Zusammenhang zwischen einem Ungleichgewicht der PR-Isoformen und Tumoraggressivität daraufhin, dass potente und selektive PR-Antagonisten in der Brustkrebsbehandlung helfen könnten. Verschiedene Antiprogestine wurden beschrieben aber nur einige werden in der Klinik für verschiedene Indikationen, wie Kontrazeption, Endometriumkarzinom und Uterine leiomyoma verwendet. In dieser Doktorarbeit wurden die Effekte des neuen Antiprogestins Lonaprisan auf die T47D Brustkrebs Zelllinie untersucht. Eine starke Proliferationshemmung und ein spezifischer Arrest in der G0/G1 Phase des Zellzyklus, sowie die Induktion des Seneszenz-Phänotyps wurden festgestellt. Dieser Arrest war abhängig von der Induktion des p21-Gens durch direkte Bindung des Lonaprisan-gebundenen PR auf dem Promotor. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass für die Stimulation der p21-Expression der Transkriptionsfaktor Sp1 notwendig war und dass reduzierte p21-Mengen die Proliferationsinhibition von Lonaprisan vermindern. Eine Mutationsanalyse zeigte, dass eine intakte PR DNA-Bindung für die Induktion von p21 nötig war. Die Phosphorylierung des PRs an der Ser345-Stelle wurde von Lonaprisan stimuliert. Diese post-transkriptionelle Modifikation wurde aber nicht für die Aktivierung des p21-Promotors benötigt, noch war die Interaktion mit c-Src erforderlich. Es konnte auch gezeigt werden, dass die PR-Expression durch p21 reguliert wird, was für einen positiven Feedback-Mechanismus zwischen PR und p21 nach Lonaprisan Behandlung spricht. Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit der Zusammenhang zwischen PR und dem Zellzyklus-regulatorischen Proteins p21 charakterisiert werden. Außerdem geben die Ergebnisse Hinweise zur Entwicklung neuer Therapien für die Behandlung des hormonabhängigen Mammakarzinom und für die Prävention der Rekurrenz.