Struktur-Funktionsanalysen am L-Typ Aminosäurentransporter 2

Abstract

Schilddrüsenhormone (SDH) sind für das Zellwachstum, den Metabolismus und die Entwicklung essentiell. Über transmembranäre Transporterproteine (TT) gelangen die SDH durch die Plasmamembran in die Zielzellen. Im Zellkern bindet das biologisch aktive SDH an den thyroid hormone receptor (THR) und initiiert die Bindung des Komplexes an die DNA. Bislang wurden unterschiedliche Subfamilien von SDH-TT identifiziert. Dazu gehören unter anderem der SDH-spezifische Monocarboxylattransporter (MCT) und die L-Typ Aminosäuretransporter (LAT). Eine wichtige Rolle in der ontogenetischen Entwicklung spielt der MCT8. Pathologische MCT8-Mutationen verhindern den SDH-Transport und verursachen das Allan-Herndon-Dudley-Syndrom (AHDS), welches durch starke neurologische Defekte gekennzeichnet ist. Im Gegensatz dazu ist kein neurologisch defizienter Phänotyp bei Mct8-Knockout-Mäusen zu erkennen. Daraus entwickelte sich die Hypothese der sekundären SDH-TT, die einen Funktionsverlust von MCT8 ausgleichen könnten. Der LAT2 ist ein potentieller Kandidat, um SDH zu transportieren. Seine SDH-Transportfähigkeit ist allerdings noch unzureichend erforscht. Die molekulare Struktur sowie der Transportmechanismus von LAT2 waren bislang ebenfalls nicht bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, die Substratspezifität von LAT2 zu charakterisieren und dessen Rolle beim SDH- Transport zu klären. LAT2 wird nur zur Plasmamembran transportiert, wenn das Eskortprotein CD98 (Cluster of differentiation 98) vorhanden ist. Daher wurden beide Proteine in Xenopus laevis Oozyten koexprimiert und die LAT2-vermittelte Aufnahme von verschiedenen radioaktiv markierten SDH untersucht. Interessanterweise konnten nur die Natrium-unabhängige Aufnahme von T2 und eine geringe Aufnahme von T3 gezeigt werden, dagegen war kein Import von rT3 oder T4 messbar. Die Aufklärung der Struktur-Funktionsbeziehung des SDH- Transports durch LAT2 erfolgte zum einen durch spezifische LAT2 Mutationen, zum anderen war aber auch eine Auswahl von Substratvarianten Gegenstand dieser Untersuchung. Hierfür wurde erstmals ein Homologiemodell des murinen LAT2 generiert. Mit dessen Hilfe wurden Aminosäurepositionen (Asn51, Tyr130, Thr132, Asn133, Gln134, Ile137, Thr140, Tyr144, Lys193, Phe242, Asn248, Phe249) ausgewählt, die im Inneren des Transportkanals lokalisiert sind und damit am Substrattransport beteiligt sein könnten. Mutationen, die nach dem Homologiemodell den Transportkanal vergrößern (N51S, Y130A, N133S, N248S), zeigten eine starke Erhöhung des 3,3'-T2-Transports. Hervorzuheben ist, dass bereits nach einer Substitution von Tyr130 durch Alanin die Aufnahme des voluminösen T4 ermöglicht wurde, obwohl dessen Transport über den Wildtyp (WT) nicht möglich war. Seitenkettenverlängerungen führten hingegen zu einem verschlechterten SDH-Transport (Y130R, I137M, T140F). Eine Ausnahme ist F242W, welches nach Seitenkettenvergrößerung einen gesteigerten SDH-Transport zeigte. Diese spezifische Position 242 benötigt eine aromatische Seitenkette, um SDH zu transportieren, denn eine konservativ hydrophobe Substitution von Phe242 zu Valin zeigte keinen SDH-Transport. Für den zweiten Teil der Substratcharakterisierung wurden chemische Substanzen ausgewählt, die in Teilen dem Molekülgerüst von Schilddrüsenhormonen oder dem spezifischen LAT- Inhibitor (BCH) ähnlich sind. Diese Inhibitionsuntersuchungen trugen dazu bei, erste charakteristische Merkmale für den Substrattransport durch LAT2 abzuleiten. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass für den Transport sowohl die Amino- als auch die Carboxylgruppe der Substrate notwendig sind. Somit ist die vollständige Aminosäurefunktion wichtig und spielt wahrscheinlich eine Rolle in der Substraterkennung. Sperrige hydrophobe oder hydrophile Substitutionen am Phenol- oder Tyrosyl-Ring sind limitierend, denn die Flexibilität der beiden aromatischen Ringe muss erhalten bleiben. Deshalb wird T4 nicht transportiert, denn es besitzt an beiden Ringen zwei Iodatome, welche die sterische Hinderung verursachen. Eine bestimmte räumliche Dimension sowie die Flexibilität des gesamten Moleküls zur Anpassung an die Bindungstasche sind hoch relevant. Inhibitionsstudien mit Iod-substituierten Substraten zeigten, wie vermutet, eine hohe Affinität zur Bindungstasche von LAT2. Erstmalig wurde in dieser Arbeit neben dem Import auch der Export von SDH über LAT2 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass LAT2 keinen SDH-Export ermöglicht. Lediglich die verkürzten Mutationen Y130A und N133S befähigten den modifizierten Transporter zur 3,3'-T2-Abgabe, jedoch nicht zu einem Export von T3 oder T4. Zusammenfassend lässt sich schlussfolgern, dass LAT2 aufgrund seiner Fähigkeit T3 aufzunehmen, tatsächlich als Kompensator beim MCT8-Funktionsverlust dienen könnte. Welche Rolle LAT2 allerdings beim 3,3'-T2-Transport im physiologischen Zusammenhang spielt, bleibt noch zu klären. Die Resultate dieser Arbeit geben erstmals einen Einblick in die Rolle des murinen LAT2 beim SDH-Transport und in dessen Transportmechanismus.

Thyroid hormones (THs) are essential for cell growth, metabolism and development. THs pass through the plasma membrane into the target cells via transporter proteins. In the cell nucleus, only the biologically active TH bind to the thyroid hormone receptor and initiate binding of the complex to the DNA. Several subfamilies of thyroid hormone transporters have been identified until now. These include the TH specific monocarboxylate transporter (MCT) and the L-type amino acid transporter (LAT). MCT8 plays an important role in ontogenetic development. Pathologic MCT8 mutations cause the Allan-Herndon-Dudley syndrome (AHDS), which is characterized by severe neurological defects. In contrast, no neurologically deficient phenotype is seen in Mct8 knockout mice. Consequently, the hypothesis of secondary TH transporters was developed, which could compensate MCT8's loss of function. LAT2 is a potential candidate for TH transport, but its TH transport capability is insufficiently explored. The molecular structure and the transport mechanism of LAT2 are not yet known. The aim of this work was to characterize the substrate specificity of LAT2 and to clarify its role in TH transport. LAT2 is only transported to the plasma membrane when the escort protein CD98 (cluster of differentiation 98) is present. Therefore, both proteins were coexpressed in Xenopus laevis oocytes and it was investigated in LAT2 mediated uptake of various radiolabeled THs. Interestingly, only the sodium-independent uptake of 3,3'-T2 and a low uptake of T3 could be shown. Furthermore, no import of rT3 or T4 was measurable. The elucidation of the structure-function relationship of LAT2 was carried out by specific LAT2 mutations as well as substrate variants. For this purpose, a homology model of the murine LAT2 was generated for the first time. With the help of the model, amino acid positions (Asn51, Tyr130, Thr132, Asn133, Gln134, Ile137, Thr140, Tyr144, Lys193, Phe242, Asn248, Phe249) were predicted to potentially interact with the substrate 3,3'-T2. Results of the modified LAT2 protein with an enlarged transport channel (N51S, Y130A, N133S, N248S) showed a strong increase in the 3,3' T2 transport. It is important to note, that T4 uptake was enabled by one substitution of Tyr130 to alanine, whereas T4 is not transported by LAT2-WT. Most side chain extensions lead to a worsened TH import (Y130R, I137M, T140F). Only F242W showed an increased TH transport after side chain enlargement. This specific position 242 requires an aromatic side chain to transport TH since substitution of Phe242 to valine did not show any TH transport. For the second part of the substrate characterization, chemical substances were selected which are partly similar to the molecular skeleton of thyroid hormones or to the LAT specific inhibitor (BCH). Competitive inhibition studies were carried out with these substrates on the 3,3'-T2 transport. These inhibition studies helped to derive first characteristic features for the substrate transport by LAT2. The results indicate that both, the amino and carboxyl groups of the substrates, are necessary for transport. This amino acid function probably plays a crucial role in substrate recognition. Bulky hydrophobic or hydrophilic substitutions on the phenol or tyrosyl ring are limiting the competition, since the flexibility of the two aromatic rings must be maintained. However, a certain spatial dimension and the flexibility of the entire molecule to adapt to the binding pocket are nevertheless relevant. Inhibition studies with iodine substituted substrates showed a high affinity for the binding pocket of LAT2. For the first time, it was investigated in the export of TH by LAT2. It was shown that LAT2 does not allow TH export. Only the mutations Y130A and N133S enabled the modified transporter to yield the 3,3'-T2 export, but not the export of T3 or T4. In summary, it was shown that LAT2 could presumably be used as a compensator for the loss of function mutations of MCT8. The role of LAT2 in the 3,3'-T2 import in the physiological context should still be clarified. The results of this work provide an insight into the role of murine LAT2 in TH transport and its transport mechanism.